不同酿酒酵母体外模拟胃肠道内环境适应性研究

2019-03-25龚发源徐智鹏陈毛清曹诗国曾雨雷胡骏鹏

中国饲料 2019年19期

龚发源，徐智鹏，，陈毛清，曹诗国，熊锋，曾雨雷，胡骏鹏，*

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.安琪酵母（崇左）有限公司，广西崇左 532201）

从20世纪初开始，饲用益生菌以其无毒副作用、无残留、无环境污染、能有效提高动物生产性能而被广泛研究并用于动物生产。目前用于畜禽饲料的益生菌，主要包括芽孢杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、片球菌、链球菌等革兰氏阳性菌以及酿酒酵母菌、克鲁维酵母菌等（Anadon等，2006）。其中酿酒酵母是安全使用时间较长且具有显著益生作用的饲用微生物，其菌体蛋白质含量高达50%以上，在畜牧业中一直作为单细胞蛋白的主要来源而被广泛使用（聂琴，2018）。此外酿酒酵母作为益生菌可以提高动物对饲料干物质、纤维素、半纤维素、蛋白质等有机物和磷酸的消化率，还能提高饲料中矿物质利用率，有助于动物充分利用饲料中的养分，同时还能有效改善家畜肠胃的菌群结构（潘宝海等，2010；王学东等，2006）、吸附肠道病原菌（Tiago等，2012）、增强家畜的免疫力和抗病力（Halas等，2012）等。

然而，动物胃肠道中存在的胃酸、胆盐及各种消化酶类是天然存在的屏障，饲用益生菌能否在动物消化道中发挥生理功能，首要在于能否有效抵抗胃肠道的天然屏障，在消化道内定植或者保持有效活菌含量。因此，本研究选取多种酿酒酵母菌株，建立体外模拟胃肠道环境模型，对酿酒酵母菌株在模拟胃肠道环境中的适应性进行评价，为饲用酿酒酵母科学有效的使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株酿酒酵母菌株及活性干酵母样品：Sc 1、Sc 2、Sc 3、Sc 4 均由安琪酵母股份有限公司提供，其中Sc 1菌株保存于安琪酵母股份有限公司生物技术研究院菌种保藏中心，菌种编号BW；Sc 2、Sc 3、Sc 4保存于武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种编号分别为CCTCC M2051226、CCTCCM2016460、CCTCC M2012116。

1.1.2 培养基及主要试剂酵母膏胨葡萄糖（YPD）液体和固体培养基：1% 酵母提取物，2%蛋白胨，2% 葡萄糖，溶解于1 L蒸馏水中，若制固体培养基，加入2%琼脂粉，灭菌待用。

猪胆盐（胆酸含量≥65%），购自北京奥博星生物技术有限公司；胃蛋白酶（酶活力≥1200 U/g）、胰蛋白酶（酶活力≥5000 U/g），氯化钠、浓盐酸、氢氧化钠等化学试剂（生化级），购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化从4℃冰箱中取出斜面培养基保存的酿酒酵母菌株，室温解冻后，接种于YPD斜面培养基进行活化，再将活化好的菌种接种到YPD液体培养基进行扩培。培养至对数生长期末期后作为活化酵母菌悬液，待用。

1.2.2 37℃生长试验将活化的菌悬液接种于YPD液体培养基（pH自然），接种量1‰，37℃下摇床培养，0、4、8、12、24 h 后进行活菌计数（cfu/mL）。

1.2.3 酸性环境适应性试验将活化的菌液接种于不同 pH 液体培养基（pH 1.0、2.0、3.0、4.0），使用自然pH作为对照，接种量1‰，最适生长温度下摇床培养，24 h后进行活菌计数（cfu/mL）。

1.2.4 人工胃液配制取质量浓度为0.1 kg/L的盐酸16.4 mL，加蒸馏水稀释，调节温度为25℃，用pH计精密调节pH为2.0。然后参考GB/T 17811-1999相关方法，加入生化级胃蛋白酶（1%），充分溶解后，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即为人工胃液。

1.2.5 人工肠液配制 Na2HPO41.36 g，加水100 mL溶解，用0.1 kg/L盐酸溶液调节pH至6.8，加水稀释至200 mL，121℃灭菌15 min，然后加入0.3%胆盐和0.1%生化级胰蛋白酶，充分溶解后用孔径0.22μm微孔滤膜过滤除菌，冷藏备用。

1.2.6 活菌培养计数用无菌生理盐水对样品进行10倍梯度稀释，每支样品选择3个稀释梯度，每个稀释度3个重复，采用平板计数法，吸取0.1 mL进行无菌涂布，静置15 min后30℃倒置恒温培养24 h，计数有效数在30～300个的平板菌落数，然后将结果换算成cfu/mL。

1.3 数据处理试验数据以“平均数±标准差”表示，采用SPSS 18.0统计软件中的one-way ANOVA进行单因素方差分析，用Duncan’s法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 37℃生长试验由图1可知，四种酿酒酵母菌株在37℃的YPD肉汤条件下均能够生长增殖，0～4 h为适应期，4～12 h为对数生长期，16～24 h为平台生长期，36 h显示活菌数相对平台期已经出现衰亡。四种酿酒酵母菌株之间对比发现，Sc 1对数生长速率最大，菌株迅速扩增，Sc 2次之；Sc 4能够达到最大活菌数108cfu/mL，Sc 2次之；Sc 1虽然在对数生长期快速增殖，但是最大活菌数却只有107cfu/mL左右。综合而言，Sc 2在37℃具有较好的生长适应性，Sc 4能够达到最大活菌数。

图1 不同酿酒酵母菌株在37℃条件下生长曲线

2.2 酸性环境适应性试验如图2所示，与自然pH的对照组相比，pH 1.0的条件下培养24 h后活菌数基本都在接种值105cfu/mL以下，说明pH 1.0的条件会显著抑制4株酿酒酵母的生长；pH 2.0条件下培养24 h后，除Sc 3和Sc 4外活菌数都在接种值105cfu/mL左右，无明显生长增殖；而pH 3.0和pH 4.0的条件中，4株酿酒酵母均能够正常生长。另外不同pH条件下对比4株酿酒酵母菌株之间生长情况发现，Sc 1对酸性环境的适应性最差，其他3株酿酒酵母都显著（P＜0.05）或者极显著（P ＜ 0.01）优于 Sc 1；而 Sc 2、Sc 3、Sc 4 之间并没有显著性差异（P＞0.05），说明除Sc 1外，其他3株酿酒酵母都具有较好的酸性环境适应性。

图2 不同酿酒酵母菌株酸性环境适应性

2.3 人工胃液耐受性试验人工胃液耐受性试验选择4株酿酒酵母菌株为种子生产的商品化活性干酵母产品（酵母活细胞数≥200亿个/g），通过平板计数加入人工胃液后0、2、4 h的酵母活菌数，计算不同时间点相对0 h的存活率，结果如表1所示。在pH 2.0，胃蛋白酶1%的模拟人工胃液中共同孵育2 h后，4种酿酒酵母的相对存活率为50%～70%，其中Sc 3的存活率最高，达到69.72%，Sc 1存活率最低，为50.07%，两者差异极显著（P＜0.01）。而共同孵育4 h后，4种酿酒酵母的相对存活率为45%～61%，Sc 4最高，存活率为60.58%，Sc 1最低，存活率为46.16%。综合而言，0～2 h时间段内，酿酒酵母衰亡明显，而2～4 h内相对存活率下降5%左右；其中，Sc 4在模拟人工胃液中的耐受性综合表现最佳。

表1 人工胃液对不同酿酒酵母相对存活率的影响%

2.4 人工肠液耐受性试验人工肠液耐受性试验同样是使用商品化活性干酵母产品（酵母活细胞数≥200亿个/g），通过平板计数计算不同时间点相对0 h的存活率，结果如表2所示，在pH 6.8、胆盐浓度0.3%、胰蛋白酶0.1%的模拟人工肠液中共同孵育2 h后，相对存活率为54%～72%，Sc 3的存活率最高，Sc 1存活率最低，两者差异极显著（P＜0.01）。共同孵育4 h后，4种酿酒酵母的相对存活率为45%～67%，Sc 3最高，存活率为66.25%，Sc 1最低，存活率为45.27%。综合而言，Sc 3在模拟人工肠液中的耐受性最佳。

表2 人工肠液对不同酿酒酵母相对存活率的影响%

3 讨论

酿酒酵母作为一个种属，本身包含多种菌株，不同菌株之间在生理生化特性上存在一定的差异。优良的饲用酿酒酵母需要具有耐受动物胃肠道内环境的能力，主要包括胃液压力和肠液压力，否则无法在动物胃肠道中发挥应有的生物学功效。胃肠道环境耐受性试验已经成为饲用益生菌筛选的一个必要内容。李顺（2007）筛选饲用活性酵母时，通过pH 2.1或者含猪胆盐0.3%的麦芽汁培养基中接种酵母菌，培养24 h，选择能够生长增殖的作为具有抗逆性的目标菌株；王鹏（2011）对分离的酿酒酵母菌株耐受性研究发现，该菌株在pH 2.0麦芽汁培养基中存活率为58.92%，pH 3.0麦芽汁培养基中存活率为91.95%，pH 4～7的培养基中都可以正常增殖；同时在0.6%胆盐浓度麦芽汁培养基中培养12 h后，依然能够增殖；肖新云等（2016）研究汉逊德巴利酵母在胃酸、肠胆盐环境的耐受性时发现，该菌株在pH 1.0的PDA培养基中无存活，pH 1.5、2.0、2.5活菌数与对照组比较下降明显（P＜0.01），耐胆盐试验中，该菌株在0.4%的高胆盐浓度PDA培养基中仍然存活，活菌数随胆盐浓度增加而降低，具有良好的抗酸、抗胆盐特性；王学东等（2018）研究不同用途酵母菌环境适应性差异发现，饲用酵母菌的酸胁迫耐受性和胆酸盐耐受性都优于面包酵母和酒精酵母，同时发现不同菌株的酸胁迫耐受性可能与其细胞内Na+、K+浓度变化有密切关系，胆酸盐耐受性可能与其胞内海藻糖积累量密切相关，与本试验结果基本一致，4株酿酒酵母菌株在体外模拟胃肠道环境的耐受性是不同的，Sc 2、Sc 3、Sc 4比Sc 1具有更好的酸性环境适应性。此外本研究考虑到养殖生产过程中的实际情况，分别使用其活性干酵母制剂在考察模拟胃肠道环境中的耐受性，发现不同用途的酿酒酵母的耐受性存在较大差异。综上，同一种属的菌种之间其环境抗逆性是存在差异的，因此选择畜禽养殖专用的益生菌，一定要综合评价菌株本身对于胃肠道环境的耐受性，这是其发挥改善肠道菌群，促进饲料消化等生理功能的前提。