四个口蘑科真菌形态学及rDNA-ITS测序鉴定

田慧敏 王秀艳 尹元 吕晓娜 李晓东

摘要：利用形态学与rDNA-ITS序列分析相结合的方法对4个口蘑科真菌样本（CFSZ10080、CFSZ10305、CFSZ11669、CFSZ10245）进行鉴定。结果表明，CFSZ10080为黄褐口蘑[Tricholoma fulvum （DC.） Bigeard & H. Guill]，CFSZ10245为鳞柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél]，CFSZ11669为银灰口蘑[Tricholoma argyraceum （Bull.） Gillet]，CFSZ10305为毛边菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.）P. Karst]，为内蒙古新记录种。4种口蘑科真菌均为优质食用菌。

关键词：口蘑科;形态学鉴定;rNDA-ITS序列

中图分类号：Q939.5         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）02-0137-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.030           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

口蘑科（Tricholomataceae）隶属担子菌门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales），该科真菌包括90余属1 800多種[1]。但是根据近期分子生物学研究结果表明白蘑科包括7个属Leucopaxillus、Tricholoma、Pseudotricholoma、Melanoleuc、Ripartites、Dennisiomyces和Corneriella等[2]。主要特征是子实体肉质，菌盖与菌柄组织连结，菌柄中生或偏生，菌褶弯生、直生，孢子印白色、淡黄色、粉红色，但在显微镜下无色或近无色[3]。该科真菌为世界性分布种，有的生于林中地上，与树木形成共生菌根，如松口蘑;有的生于蚁巢中，如白蚁伞;有的生于草地，如蒙古口蘑，可形成蘑菇圈。该科包括多种美味可食的蘑菇，如草原口蘑、松口蘑、蒙古口蘑、紫丁香蘑等。有多种口蘑科真菌具抗癌、抗病毒、降血压等功能[4-6]。然而，也有的口蘑含毒素，如皂味口蘑（Tricholoma saponaceum）。口蘑科真菌种类繁多，分类复杂，传统的形态特征分类鉴定带有一定的局限性和主观性。近些年来rDNA-ITS测序法已大量用于对口蘑科真菌的菌种鉴定、系统发育及亲缘关系分析中[7-11]。

本研究拟对赤峰地区4个口蘑科真菌利用形态学特征和ITS片段测序相结合的方法进行鉴定，以期探索口蘑科真菌的准确鉴定方法，为真菌开发利用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料来源

供试标本CFSZ10080、CFSZ10245、CFSZ10305、CFSZ11669，其中，CFSZ11669采自内蒙古赤峰市松山区老府镇神仙沟风景区，其他均采集于赛罕乌拉国家级自然保护区。标本经拍摄生境照片、观察形态、测量数据，晾干、编号，超低温冷冻处理之后存放于赤峰学院菌物标本室（CFSZ）。

1.2  形态鉴定

采用宏观特征和显微结构的鉴定方法。宏观特征采用肉眼观察、游标卡尺测量等方法，需要测量供试样本的新鲜子实体大小、颜色，菌柄长度以及直径，菌盖直径。进行检索、比对、定种;显微结构在光学显微镜（奥特BED203）下观察和测量孢子、担子、菌盖表皮、菌柄表皮菌丝形态及大小，所有数据均测量20个，用显微照相系统（Olympus BX53）拍摄显微结构相片，孢子测量Q1（长宽比范围）和Q2（长宽比平均值）。

1.3  ITS鉴定

1.3.1  DNA的提取  样品子实体菌盖部分经研磨称量后，称取30 mg，提取基因组DNA时使用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产的基因组DNA提取试剂盒完成。

1.3.2  PCR扩增  PCR扩增反应在PCR扩增仪（Eppendorf 5331）上进行。

利用引物ITS1/ITS4 PCR扩增后，PCR体系为50 μL体系，再1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3  DNA纯化及测序  样品PCR扩增产物经Takara胶纯化试剂盒纯化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成测序。

1.3.4  ITS序列比对分析  将已测得的ITS序列，通过Chromas软件进行处理，将得到的ITS序列在GenBank数据库中进行Blast检索，从结果中挑选出同源性较高的ITS序列，利用软件MEGA 5.1构建系统发育树，发育树的每个分支的统计学显著性分析以最大似然法进行检验，重复次数为1 000次。

2  结果与分析

2.1  形态学鉴定结果

经形态学鉴定，CFSZ10080为黄褐口蘑[Tricholoma fulvum（DC.） Bigeard & H. Guill]，CFSZ10245为鳞柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél]，CFSZ11669为银灰口蘑[Tricholoma argyraceum（Bull.） Gillet]，CFSZ10305为毛边菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.）P. Karst]。

2.1.1  黄褐口蘑[Tricholoma fulvum （DC.） Bigeard & H. Guill]  子实体中等偏小，菌盖直径2.5～3.5 cm，半球形，中间凸起，后平展，黄褐色或酒红色，边缘内卷，盖缘平滑，表面光滑，湿时黏，菌褶稍延伸，湿时奶白色，干后变为肉桂色，具橘色色调，遇KOH变黑，菌肉白色，具蘑菇香味，菌肉遇KOH变红色，菌柄长2.2～4.8 cm，粗0.3～0.6 cm，黄棕色，色稍浅于菌盖，湿时稍黏，圆柱状，基部膨大，有白色绒毛，表面光滑，黄色或淡棕色

孢子（4.8～6.2） μm×（3.6～5.3） μm，Q1=1.09～1.67，Q2=1.27±0.18，宽椭圆形，有小尖，表面光滑，无色，非淀粉质，担子（19.0～31.0） μm×（5.0～7.2） μm，无色，棒状，顶端膨大，具4个小梗，褶侧囊体和褶缘囊体均无，菌盖菌丝无色，有淡棕色内含物，遇KOH变为红棕色，具均匀隔膜，直径4.8～7.0 μm，菌柄表皮菌丝排列整齐，淡黄色，有隔膜，直径7.5～12.0 μm。

研究标本：内蒙古赤峰市巴林右旗（43°12′-

44°28′N，118°11′-120°05′E），赛罕乌拉自然保护区，正沟松林地上，CFSZ10080，2013年8月13日，刘铁志、田慧敏、赵艳龙、吴晶。

该种与红鳞口蘑（Tricholoma vaccinum）、鳞盖口蘑（Tricholoma imbricatum）很相似，但是红鳞口蘑菌盖边缘有残留的菌幕，菌盖被红褐色毛状鳞片[11]，鳞盖口蘑菌盖表面不黏，深棕色，密被纤毛状鳞片[12]。而标本CFSZ10080菌盖红棕色或黄棕色，菌盖黏，菌柄浅黄棕色，伤后或老后颜色加深。故鉴定为黄褐口蘑，可食用。

2.1.2  鳞柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél  子实体中等偏小，菌盖直径2.9～3.9 cm，半球形，中间凸起，后平展，红褐色，边缘内卷，盖缘平滑，湿时稍黏，菌褶稍延伸，湿时奶白色，干后变为红棕色，菌肉白色，遇KOH变红色，菌柄长4.6～5.5 cm，粗1.0～1.2 cm，红棕色，圆柱状，基部膨大，有白色绒毛，中实，干后空，中空，表面具棕色纤毛，伤后或老后颜色变深。

孢子（4.4～7.2） μm×（3.8～5.0） μm，Q1=1.05～1.67，Q2=1.29±0.19，宽椭圆形，有小尖，表面光滑，无色，担子（19～36） μm×（5～6） μm，无色，棒状，顶端膨大，具4个小梗，褶侧囊体和褶缘囊体均无，菌盖菌丝无色，有的具淡棕色内含物，遇KOH变为红棕色，具均匀隔膜，直径4.8～9.6 μm，菌柄表皮菌丝排列整齐，无色，有隔膜，直径2.5～6.0 μm。

研究标本：内蒙古赤峰市巴林右旗（43°12′-44°28′N，118°11′-120°05′E），赛罕乌拉自然保护区，荣升白桦林地上，CFSZ10245，2013年8月16日，刘铁志、田慧敏、赵艳龙、吴晶。

该种与锈色口蘑（Tricholoma pessundatum）、多鳞口蘑（Tricholoma muricatum）、长根口蘑（Tricholoma nictitans）极其相似，但锈色口蘑、多鳞口蘑菌盖表皮很黏，菌盖表皮具胶化的菌丝[12-15]。标本CFSZ10245菌盖无胶化菌丝，有的具淡棕色颗粒状内含物，主要分布于桦木林，而后三者均与松柏科植物形成共生菌根，多鳞口蘑、长根口蘑菌柄具较长的根，嵌入土壤中[15]，且分子鉴定结果显示该标本与长根口蘑、多鳞口蘑相似度很低，故鉴定为鳞柄口蘑，可食用。

2.1.3  银灰口蘑[Tricholoma argyraceum（Bull.） Gillet]  子实体中等偏小，菌盖直径2.2～3.8 cm，半球形，中间稍凸起，后平展，白色，具棕灰色纤毛状鳞片，中间鳞片密集，老后边缘开裂，菌肉白色，厚，无气味;菌褶白色，直生或弯生，具短菌褶，从盖缘发出，菌柄圆柱状，长4.6～5.5 cm，粗1.0～1.2 cm，污白色，基部稍膨大，具细软毛有白色绒毛，中实，干后空。

孢子（5.0～6.5） μm×（2.2～3.6） μm，Q1=（1.4～）1.5～2.0（～2.2），Q2=2.01±0.23，寬椭圆形，有小尖，表面光滑，无色，中间有一大油滴，担子（23.5～30.0） μm×（9.1～10.1） μm，无色，棒状，具4个小梗，褶侧囊体无，褶缘囊体棒状，（14.5～28.6） μm×（3.2～6.5） μm菌盖表皮均由排列整齐、首尾相接的菌丝组成，无色，菌丝隔膜多，均匀，（17.5～61.5） μm×（4.6～7.2） μm，菌柄表皮菌丝排列整齐，无色，有隔膜，直径6.0～7.5 μm。

研究标本：内蒙古赤峰市松山区神仙沟风景区阔叶林地上群生，CFSZ11669，2016年9月16日，田慧敏等。

该种与棕灰口蘑（Tricholoma terreum）、雕纹口蘑（Tricholoma scalpturatum）极其相似，3种口蘑在内蒙古地区均有分布，但是棕灰口蘑孢子很大，5.5～9.0 μm，菌盖具有分化的椭圆形菌丝（14～50） μm×（4.0～15） μm[12，13，16];而银灰口蘑孢子较小，（5.0～6.5） μm×（2.2～3.6） μm，菌盖表皮也不具有膨大的菌丝，菌丝细胞大小为（17.5～61.5） μm×（4.6～7.2） μm。而与雕纹口蘑（Tricholoma scalpturatum）的区别为银灰口蘑伤后或老后菌褶不变色，孢子长椭圆形，长宽比值大，Q1=（1.42～）1.5～2.0（～2.2），雕纹口蘑菌褶受伤或老慢慢变黄，孢子宽椭圆形，长宽比较小，Q1=（1.2～）1.3～1.5（～1.7）[16]。因此鉴定为银灰口蘑[Tricholoma argyraceum （Bull.） Gillet]。可食用，味道鲜味，当地群众喜欢采食，并收集加工、盐渍。

2.1.4  毛边菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.） P. Karst]  子实体中等偏小，菌盖直径2.5～3.7 cm，浅漏斗状，奶白色，干后变肉色或浅黄棕色，有1～2圈不明显的同心环纹，边缘具条纹，盖缘有短绒毛，菌褶土黄色或黄棕色，菌肉及菌盖表皮遇KOH不变色，菌柄长2.5～5.0 cm，粗0.2～0.5 cm，稍弯曲，浅肉色，干后黄褐色，光滑，基部具白色绒毛。

孢子（4.8～6.5） μm×（4.1～6.0） μm，Q1=0.95～1.26，Q2=1.10±0.08，椭圆形，近球形，表面有小刺，淡黄色，担子（20～26） μm×（5.0～7.2） μm，无色，棒状，顶端不膨大，具4个小梗，褶侧囊体和褶缘囊体均无，菌盖由两种菌丝组成，一种为膨大的菌丝，无色，具均匀隔膜，直径12.0～19.2 μm，另一种菌丝具锁状联合，无色，直径5.3～10 μm，菌柄菌丝排列整齐，无色，膨大，直径9.6～13.2 μm。

研究标本：内蒙古赤峰市巴林右旗，（43°12′-44°28′N，118°11′-120°05′E），赛罕乌拉自然保护区，荣升白桦林地上，CFSZ10305，2013年8月17日，刘铁志、田慧敏、赵艳龙、万威。

该种为毛缘菇属模式种，主要特征：菌盖白色，具稀疏的长绒毛，边缘具刚毛，孢子有小疣，2013年在吉林省延边和龙市首次报道，但没有描述，此种为内蒙古新记录种[17]。

2.2  rDNA-ITS测序鉴定结果

2.2.1  供试样品测序结果  PCR扩增的4个样品子实体DNA的ITS序列，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，CFSZ10080 NCBI登录号为MG367245和MG36724546，序列长度为660 bp左右，CFSZ10245 NCBI登录号为MG367243和MG36724544，序列长度为650 bp左右，CFSZ11669 NCBI登录号为MG36724310305，序列长度为640 bp，CFSZ10305 NCBI登录号为MG367241，序列长度为640 bp左右。

2.2.2  ITS序列比对与系统发育树分析  将4个标本的ITS序列与GenBank数据库进行比对分析，获得26个序列，与供试口蘑科真菌具有较高相似度。

对4个样本CFSZ10080、CFSZ10245、CFSZ10305、

CFSZ11669的ITS序列与26个相似序列构建系统发育树，以Melanoleuca polioleuca为外群。结果表明，与4个供试标本相似的26个来自GenBank最相似的序列共分为2大分支，一支为铦囊蘑属（Melanoleuca），另一支为口蘑属（Tricholoma）、香蘑属（Lepista）、毛边菇属（Ripartites），其中CFSZ10305与Ripartites tricholoma聚在一起，结合形态特征将标本CFSZ10305鉴定为毛边菇（Ripartites tricholoma）。CFSZ10080与Tricholoma fulvum聚在一起，CFSZ10245与Tricholoma psammopus聚在一起，结合形态特征分别鉴定为黄褐口蘑和鳞柄口蘑，二者均属于口蘑属（Tricholoma section Lasciva）。CFSZ11669与Tricholoma argyraceum聚在一起，鉴定为银灰口蘑，属Tricholoma section Terrea。

3  小结与讨论

本研究中分子鉴定结果与形态鉴定结果基本吻合，CFSZ10080鉴定为黄褐口蘑，CFSZ10245鉴定为鳞柄口蘑，CFSZ11669鉴定为银灰口蘑，CFSZ10305鉴定为毛边菇，其中，毛边菇为内蒙古新记录种，据Index of Fungorum统计，毛边菇属目前仅有16种和变种，该属真菌外形特征似杯伞，但具有黄色、球形、带刺的孢子[18]。中国仅两种，主要在吉林省延边和龙市[17]，而黄褐口蘑、鳞柄口蘑和银灰口蘑均为优质食用菌。本研究为口蘑科真菌的鉴定提供了方法，是内蒙古菌物资源的完善和补充，也为优质食用菌的開发利用提供了依据。

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