不同产地广藿香的SCoT分子鉴定

席秀利 胡珊 邬龙怡 孟鹤

摘要：通过提取广藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.]DNA，正交设计PCR反应体系，筛选获得广藿香PCR扩增的SCoT引物，应用NTsys 2.10e软件并采用UPGMA法进行聚类分析，对分布于广州、阳江、肇庆、湛江和海南等共16个居群的广藿香样品进行分子鉴定。结果表明，SCoT引物碱基序列共扩增出167条条带，其中多态性条带有108条，多态百分率占64.7%，各品种间的相似系数分布在0.69～0.91，不同产地广藿香分别聚为一类。表明不同产地广藿香有丰富的遗传多态性，且SCoT分子标记可以作为不同产地广藿香的鉴定依据。

关键词：广藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.];SCoT;分子鉴定;正交

中图分类号：R282         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）02-0084-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.019           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

广藿香为唇形科植物广藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.]干燥地上部分，为“十大广药”之一。其味辛，性微温，归脾、胃、肺经，具有芳香化浊，开胃止呕，发表解暑的功效[1]。药材市场传统上将广蕾香分为牌香（广州产）、肇香（肇庆产）、湛香（湛江产）和南香（海南产）[2]。广藿香不同产地的分化类型，是适应特定环境的结果，本质上由遗传变异所决定[3]。目前，真正意义上的道地药材石牌藿香已经不复存在，经验认为肇庆地区的广藿香的品质与石牌藿香相近，亦供药用，而海南藿香和湛江藿香不供药用，主要用于提取挥发油[4]。为了进一步利用广藿香药材资源，充分发挥广藿香这一著名南药的价值，有必要将不同品种广藿香进行区分。

SCoT（目标起始密码子多态性分子标记，Start

codon targeted polymorphism）是Collard和Mackill开发的基于SPAR（单引物扩增反应）的新的目的基因分子标记方法[5]。SCoT标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点，操作简单，成本低，引物通用，多态性丰富，可用于分子辅助育种[6]。分子鉴别成为一大趋势，目前广藿香品种鉴定的分子生物研究有RAPD[7]、MSAP[8]、SRAP[9]、ITS[10]、psbA-trnH[11]，然而鲜见有关SCoT标记在广藿香亲缘关系鉴定中应用的研究报道。因此，本研究将来自不同产地包括广州市、湛江市、阳江市、肇庆市、海南省等地的广藿香样品进行SCoT分子标记鉴定，以期为广藿香育种及其药材质量鉴定提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

采集16個不同产地广藿香样品（表1），经广州中医药大学黄海波副教授鉴定为广藿香，凭证标本保存于香雪制药有限公司研发中心。详细记录样品信息及编号，用75%乙醇清洁叶表面后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2  仪器和试剂

分析天平，离心机，核酸蛋白测定仪（Implen Nanophotometer），PCR仪（BIO-RAD），凝胶成像仪（BIO-RAD），超低温冰箱（Thermo 902-ULTS），电泳仪、电泳槽（BIO-RAD），制冰机，水浴锅。

dNTPs、Ex Taq DNA聚合酶、Mg2+、10×Ex Taq Buffer、Loing Buffer（Takala），Maker 3（广州东盛生物科技有限公司），琼脂糖（Biowest），Golden View核酸染料（北京博凌科为生物科技有限公司），TAE（50×）[生工生物工程（上海）股份有限公司]，植物基因组提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，参考Collard等[5]提供的36条SCoT引物序列。

1.3  方法

1.3.1  基因组DNA提取与检测  采用天根植物基因组试剂盒提取基因组DNA。用微量紫外核酸仪检测DNA浓度和纯度。将合格样品DNA浓度稀释至20 ng/μL后置于-20 ℃保存备用。

1.3.2  SCoT-PCR 反应体系正交优化  选用L16（54）正交试验设计（表2），对Mg2+、dNTPs浓度、Ex Taq DNA聚合酶、引物和DNA用量进行5因素4水平的正交试验。以广藿香GZ的DNA为模板，随机挑选S12号引物作为扩增引物，反应总体积20 μL，含有10×PCR Buffer 2 μL，每处理重复2次。

1.3.3  SCoT-PCR引物筛选  根据正交试验结果选择最佳反应体系对36条引物进行筛选，设平行组。接着对筛选后的引物进行温度筛选，在PCR仪上设定50～60 ℃温度区间，即50.0、50.9、52.3、54.0、56.3、58.1、59.3、60.0 ℃ 8个温度梯度进行退火温度筛选。然后选择湛江市、阳江市、肇庆市高要区3个不同产地的广藿香DNA为模板，按照上述优化的SCoT-PCR体系进行SCoT分子标记，筛选出多态性好、条带清晰的引物。

1.3.4  SCoT-PCR 扩增与检测  PCR扩增反应在PCR仪上进行，扩增程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环;72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。扩增反应结束后，取10 μL扩增产物加入2 μL 6×loading buffer，采用2.0%琼脂糖凝胶，在1×TAE电极缓冲液中，120 V，电泳30 min检测条带，凝胶成像仪下拍照。

1.4  数据分析

根据PCR扩增产物的电泳结果，对清晰且易于辨认的条带采用“0/1”系统记录其位置，建立SCoT标记的0/1矩阵。用NTsys 2.10 e软件计算样品间的相似系数，并用不加权成对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。

2  结果与分析

2.1  DNA提取结果

将提取的所有广藿香样品在超微量紫外分光光度计下测量其浓度和纯度，得到其A260 nm/A280 nm均在1.8～1.9，说明其DNA纯度高，符合PCR的技术要求。

2.2  SCoT-PCR反应体系正交优化结果

使用引物S12对反应体系优化的电泳结果，参考桂腾琴等[12]直观评价法依次对结果多态性进行评分，条带数量丰富、清晰的计16分，涂布或无条带的计1分，反应1～16组体系的平均整数计分依次为8、9、15、16、8、9、11、12、10、10、7、9、13、12、14、11分。依照计分原则，计算同一水平下各个因素的平均值Kn（表3）。根据各因素水平下的得分数据平均值Kn（K值得分最高）可以确定各个因素的最适浓度。由表3中的K值可以初步确定5个因素的最适用量分别为1×PCR buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.30 mol/L dNTPs，0.6 μmol/L Primer，1.25 U ExTaq酶，40 ng模板DNA。但鉴于1.00 U Ex Taq酶与1.25 U Ex Taq酶组评分不相上下，从经济角度考虑体系最终确定为1×PCR buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mol/L dNTPs，0.6 μmol/L Primer，1.00 U Ex Taq酶。

2.3  引物筛选及退火温度优化

以最佳反应体系对36条SCoT通用引物进行筛选，重复2次初筛选出20条引物，进行8个退火温度梯度筛选，根据信号强度判断条带，采用区间温度对筛选的引物进行匹配最终获得在52、56、59 ℃ 3个温度扩增下的18条引物。其中，S33和S34号引物的退火温度梯度电泳结果。

2.4  SCoT扩增的多态性分析

以湛江市、阳江市、高要区3个地域差异大的样品对退火优化后的18条引物进行多态性筛选，最终获得16条扩增带型完整、清晰、多态性丰畗的引物（表4）。利用这16条引物对16份材料进行SCoT扩增，共获得总条带167条，其中多态性条带共108条，多态百分率占64.7%，多态性比率较高，在分子水平上证实了广藿香具有丰富的种内遗传多样性。S25、S29号引物对16份材料SCoT-PCR扩增电泳结果。

2.5  SCoT标记的遗传相似性及聚类分析

利用NTsys 2.10e软件构建全部材料基于SCoT数据的UPGMA树状图。16份材料两两之间的相似系数在0.69～0.91，其中湛江市的Z2与Z3样品以及肇庆市的Q1与Q2，同广州市龙洞的P2与N1相似度最高达0.897。而海南省隆江镇的样品N2与其他样品亲缘关系较远，相似度仅有0.69。以相似系数0.80为阈值可将16份材料划分为4组，其中湛江市的3个样品和阳江市的3个样品聚为一支;肇庆市高要区的3个样品与2个牌香样品、南香N1、广藿香GZ则聚为一支;广藿香GY和南香N2分别单独成为一支。由此可见，地域靠的越近的广藿香样品相似度较高，且亲缘关系更近，不同产地广藿香大致聚为一类。说明SCoT分子标记可以作为不同产地广藿香的鉴定依据。

3  小结与讨论

SCoT标记作为一种新型的目的基因分子标记，在试验过程中发现该方法不仅具有操作简單，而且重复性好，同时引物通用性强。本试验从最初的36条SCoT通用引物中最终筛选出16条清晰、条带丰富的引物作为不同产地广藿香SCoT分子标记的引物，验证了其稳定性及可靠性。筛选的16条SCoT引物扩增多态百分率占64.7%，在分子水平上证实了不同产地广藿香样品具有丰富的种内遗传多样性。

通过NTsys 2.10e软件进行相似系数和UPGMA聚类分析发现，16份样品广藿香的相似度分布在0.69～0.91，而以相似度0.80为界限，所有样品聚为4支。从聚类分析中可以看到，不同产地广藿香样品相似度较高，基本聚为一类。然而同一个地方培育的不同品种受地理位置影响，亲缘关系更近，相似度高，以同采于广州市龙洞的牌香P2与南香N1样品为例，两者相似度达到0.897。而产于海南省隆江镇的N2样品却与其他样品相似度较低，亲缘关系较远，这说明了基因表型可能受到地理位置的影响发生变化，这与刘玉萍等[3]研究认为广藿香不同产地的分化类型是适应特定环境的结果，本质上由遗传变异所决定的结论一致。因此，从结果分析得知SCoT分子标记可以在分子层面上对不同产地广藿香进行大致区分，可作为不同产地广藿香的鉴定依据。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：化工工业出版社，2015.

[2] 广东中药志编委会.广东中药志.第2卷[M].广州：广东科技出版社，1996.

[3] 刘玉萍，罗集鹏，冯毅凡，等.广霍香的基因序列与挥发油化学型的相关性分析[J].药学学报，2002，37（4）：304-308.

[4] 林小桦，贺  红.广藿香种质资源的研究现状及存在问题[J].现代中药研究与实践，2005，19（4）：60-62.

[5] COLLARD B C Y，MACKILL D J.Start codon targeted （SCoT）polymorphism：A simple，novel DNA marker technique for generating genetargeted markers in plants[J].Plant Mol Biol Rep，2009，27（1）：86-93.

[6] 熊发前，唐荣华，陈忠良，等.目标起始密码子多态性（SCoT）：一种基于翻译起始位点目的基因标记技术[J].分子植物育种，2009，7（3）：635-638.

[7] 李  颖，李劲平.广霍香道地性的RAPD研究[J].中医中药与中西医结合，2006，22（13）：2027-2028.

[8] 黄洁燕，卢慧娟，熊  燕，等.广藿香MSAP分析技术体系的优化及引物筛选[J].广东药学院学报，2014，30（1）：28-35.

[9] 吴友根，郭巧生，何际婵，等.正交设计优化广藿香基因组SRAP扩增体系的研究[J].江苏农业科学，2010（4）：18-21.

[10] 张  英，陈  瑶，张金超，等.广藿香ITS基因型与地理分布的相关性分析[J].药学学报，2007，42（1）：93-97.

[11] 黄洁燕，卢慧娟，谢  晖，等.基于psbA_trnH序列对广藿香与藿香、广防风的分子鉴定[J].广东药学院学报，2014，30（6）： 683-687.

[12] 桂腾琴，孙  敏，乔爱民，等.正交设计优化果梅ISSR反应体系[J].果树学报，2009，26（1）：108-112.