OCT对冠状动脉粥样硬化及心肌梗死的法医病理学辅助诊断

李洋，张宁，王成铭，何光龙

（1.公安部物证鉴定中心 法医病理损伤技术处，北京 100038；2.公安部物证鉴定中心 视频侦查技术处，北京 100038；3.清华大学物理系，北京 100084）

在法医影像学领域，目前的研究主要基于CT进行人体三维重建开展死后虚拟解剖。虚拟解剖能够在短时间内对尸体进行全身检查，作出影像学诊断，在分析颅脑损伤、高坠及其他常规解剖难以发现机体损伤的案件中发挥着重要作用[1]。但是，基于CT技术的虚拟解剖，其限制在于平台要求高，重建时间长，对操作者有一定放射伤害，分辨率较光学显微镜低，无法发现微米级的病变结构和组织，因此对于组织器官显微结构的影像观察仍然依赖传统法医病理学技术[2]。传统法医病理学技术主要对尸体、离体器官组织进行系统解剖，从而解释死亡原因、死亡时间、损伤时间、致伤物推断等问题。通常情况下，法医病理学家需要通过对不同器官进行组织病理学检验，才能对死亡原因等问题做出正确的鉴定。经典的组织病理学检查是利用苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色方法，在显微镜下观察细胞水平上的变化，从而提高法医病理学家对疾病或者损伤的诊断准确性。但是，病理切片制作过程复杂，对操作水平要求较高，人为假象、死后腐败等因素也会干扰法医病理学取材，对病理切片的结果产生负面影响。

光学相干断层成像（optical coherence tomography，OCT）是近年出现的一种新型光学影像技术，其成像特点是对机体无损伤，无需接触即可获得具有极高空间分辨率的二维图片，并能进一步形成三维断层体成像，目前，OCT已开始应用于临床医学，并取得良好效果，如检查眼球结构、冠状动脉管腔等[3-4]。而在法庭科学领域，ZHANG等[5]指出OCT对不同品牌汽车油漆有较好的辨识度，有望成为交通事故现场快速检验的技术手段。目前，已有法医学者开始研究OCT在法医病理学中的应用价值。NAPOLI等[6]指出，在动物实验中可利用OCT检测眼角膜的厚度进而推断死亡时间。BROWN等[7]通过观察OCT图像中蝇类虫蛹发育程度而推断死亡时间。

因此，本实验拟观察OCT横切面图像与传统HE染色组织病理学切片的异同，以明确OCT在人体组织的成像特点，初步探索该技术在法医病理学中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料

OCT系统（自主搭建[5]），ShandonTMExcelsiorTMES组织脱水机、HistoStarTM组织包埋机、ShandonTMFinesseTME+石蜡切片机、VaristainTMGemini ES自动玻片染色机（美国Thermo Fisher Scientific公司），光学显微镜（日本奥林巴斯公司），Infinity2-3（美国Lumenera公司），Image-Pro Plus®6.0.0.260软件（美国Media Cybernetic公司），多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司），苏木素（美国Thermo Fisher Scientific公司）和伊红（北京九州柏林生物科技有限公司）。

1.2 实验样本

本次实验样本来源于公安部物证鉴定中心及北京市公安局法医中心5名男性，死亡原因鉴定意见均为冠心病急性发作猝死，大体器官及组织病理学检验均可见左、右冠状动脉粥样硬化病理学改变。本研究分别采集每具尸体的心脏左右冠状动脉粥样硬化病变横断面、左心室前壁陈旧性心肌梗死横断面和正常心肌组织各1份，实验样本取材约为1.5 cm×1.5 cm×2.0mm。

1.3 OCT操作流程及相关参数

本研究中OCT系统深度分辨率约6 μm，横向分辨率约7 μm，线扫描速率为70 kHz。系统使用宽带超辐射发光二极管（superluminescent light-emitting diode，SLD）近红外光源，中心波长为832 nm，谱带半高全宽60.4 nm，输出功率13 mW。曝光时间设置为15μs，系统信噪比约96dB。样品的横向扫描由样品臂的一组扫描振镜实现。振镜与图形采集保持同步。图像采集、处理和显示均由基于C++自主开发的软件进行。三维图像渲染由Visage ImagingTMAmira®5.3.3软件（澳大利亚Visage Imaging公司）实现。

OCT操作过程：使用脱脂纱布将实验样本表面水分擦干，用解剖刀修平表面，将样本放在OCT系统扫描平台上，打开光源和振镜，开启数据采集软件，设置电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）积分时间为15 μm，扫描范围6 mm×6 mm。定位扫面区域后，开启采集按钮对样本表面进行扫描，即得到OCT图像，采集时间0.5～1min。

1.4 组织病理学检验

实验样本浸没于4%多聚甲醛-PBS液室温固定24h后，进入标准脱水、浸蜡、包埋组织切片过程。以5 μm厚度连续切片，然后进行标准HE染色，中性树脂封片后置于光学显微镜下观察，利用Infinity2-3截取视野图像。

1.5 测量指标

利用Adobe Photoshop CS6（美国Adobe公司）随机测量10张OCT图像、利用Infinity2-3测量10张组织病理切片中的动脉粥样硬化灶纤维帽、中膜厚度及脂质池数量。

使用Image-Pro Plus®6.0.0.260软件对正常心肌与陈旧性心肌梗死区各5张OCT图像分别进行不同区域相同面积的累积光密度值（integrated optical density，IOD）测定。

1.6 统计学方法

通过形态学方法比较不同程度冠状动脉粥样硬化（Ⅰ级和Ⅳ级）[8]，心肌梗死病灶各结构在OCT图像和光学显微镜上的异同。实验数据采用±s表示，使用SPSS 22.0软件对纤维帽、中膜厚度、脂质池数量进行配对样本t检验，对正常心肌与陈旧性心肌梗死病灶的IOD值进行独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 Ⅰ级冠状动脉粥样硬化

光学显微镜（图1A～B）能较好地区分管壁三层结构，其中内膜增厚，可见纤维增生及泡沫细胞等粥样硬化早期病理学改变。

OCT图像（图1C～D）中，冠状动脉中膜、外膜分层较清晰，并能清楚显示内膜表面的纤维帽结构，此外内膜中可见光密度较低的增生纤维组织，内膜出现不连续性病理改变。

图1 Ⅰ级冠状动脉粥样硬化

2.2 Ⅳ级冠状动脉粥样硬化

光学显微镜（图2A～B）下，冠状动脉内膜明显增厚，粥样斑块形成并向管腔膨出。斑块中可见灶性中性粒细胞浸润，底部可见胆固醇结晶裂隙及无结构的粥样物质。

OCT图像（图2C～D）可见，管腔狭窄严重，粥样斑块向管腔增生，斑块中无定形物质的光密度呈不均匀结构。病变严重区域的中膜弹力纤维变薄。管腔中的血凝块组织呈强光反射性。

图2 Ⅳ级冠状动脉粥样硬化

2.3 心肌梗死灶

光学显微镜（图3A）下可见陈旧梗死灶，表现为大量纤维瘢痕组织替代正常心肌，在纤维结缔组织中血管明显淤血（图3B）。纤维组织与正常心肌组织界限较明显，可见部分纤维组织插入周围正常心肌中。

OCT图像（图3C）中正常心肌组织光信号较弱，呈高吸光性，而心肌梗死区纤维瘢痕组织内则显示出较强光信号，呈低吸光性，正常心肌与陈旧心肌梗死区有较明显的界限。此外，纤维组织中的血管呈高吸光性。淤血的血管与纤维结缔组织有较好的辨识度（图3D）。

2.4 其他组织

此外，我们通过对比心外膜OCT与HE图像发现：OCT图像中神经组织与血管中凝血块均呈低吸光性，而脂肪细胞OCT图像中能明显区分细胞膜及内部脂滴（图4）。

2.5 测量指标比较

分别测量OCT图像和光学显微镜图像上冠状动脉粥样硬化病灶处纤维帽和中膜的厚度，OCT图像中冠状动脉粥样硬化灶纤维帽厚度平均为（55.24±25.08）μm，光学显微镜图像上纤维帽厚度为（77.30±98.25）μm，两者间差异无统计学意义（P=0.493）。OCT与HE图像中的中膜厚度分别为（74.77±31.21）μm、（89.78±68.68）μm，两者间差异无统计学意义（P=0.451）。OCT与HE图像中的脂质池数量均为7个，差异无统计学意义（P＞0.05）。

正常心肌组织的IOD值（3 707.90±962.98）与陈旧性心肌梗死区的IOD值（1 226.24±622.66）之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 左心室前壁心肌梗死灶

图4 心外膜下组织

3 讨 论

在鉴定冠心病急性发作导致的猝死案件过程中，如果法医病理学专家能借助辅助技术手段在尸体检验时快速、准确地取到病变组织并进行组织病理学检验，一方面能缩短法医病理鉴定时间，另一方面也能为诊断提供辅助依据。

OCT作为一种新兴影像学技术已被临床学者用于指导冠心病早期预防、治疗及预后过程。例如，KUME等[9]在临床试验中发现，OCT技术可以对活体冠状动脉病变的程度进行有效评估，其图像的分辨率优于目前临床B超的结果。因为具有高分辨率、实时、穿透组织等特点，利用OCT可对组织进行简便、快捷、直观的光学影像观察，这在法医病理学快速筛查、初步诊断方面无疑是有一定应用价值的。ADLAM等[10]指出，OCT有希望成为一种对尸体损伤较小的诊断心脏性猝死的工具，遗憾的是ADLAM没有讨论OCT图像与光学显微镜图像之间的对应关系。而本研究结果显示，OCT图像与光学显微镜下HE图像在动脉粥样硬化病理特征，包括粥样硬化斑块、内膜纤维帽及内膜厚度变化等方面都有较好的相关性。

在法医学实践中，判断血管内血栓成因对死后疾病诊断有重要价值。本课题组研究发现，在OCT图像中，血管中的凝血块呈现不同程度的光密度值。根据KUME等[11]的进一步研究，血栓成分不同可造成OCT图像上血凝块亮度上的不同。基于KUME等及本研究的结果，认为法医病理学者可以利用OCT技术辅助区分血栓类型。

同时，本研究结果显示，OCT图像上正常心肌与陈旧性心肌梗死区之间存在明显的界限，其原因可能为：相比正常心肌组织，纤维瘢痕较致密，对可见光、近红外光具有较强的反射、散射能力。此外，正常心肌和陈旧性心肌病灶区的IOD值之间差异有统计学意义。这些结果都说明，OCT图像能有效地辨识正常心肌组织和陈旧性心肌病灶。此外，在OCT影像中，除了冠状动脉各层、心肌、纤维瘢痕等组织，神经、脂肪组织在OCT图像与光学显微镜图像中也有良好对应关系，这些表明，OCT能够反映出HE染色结果。

本研究证明，OCT技术可在心脏大体检验时进行病理组织学的初筛，辅助法医病理学专家对冠状动脉粥样硬化、心肌纤维化程度进行预判，有针对性地取材，以利于下一步工作。而对于其他重要器官，如脑、肺、肾等，OCT技术是否同样能够反映出组织病理改变仍需要进一步研究。