超声波辅助提取锁阳黄酮及其动力学分析

张喜峰，杜玉雕，罗光宏，杨生辉，王丹霞

(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000；3.河西学院甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃 张掖 734000)

锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)是锁阳科锁阳属的单科单属单种植物，多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(Natraria)植物根部，是全寄生种子植物，主要产于西部戈壁和沙漠[1].锁阳营养成分丰富，含有多糖、皂苷、黄酮、原花青素、木脂素和生物碱等多种活性物质[2-4].近年来，关于锁阳黄酮的提取和药理活性的报道较多.张勇等[5]采用乙醇水溶液回流提取锁阳黄酮，在80 ℃采用50%乙醇回流提取1.5 h，提取效果较好；栾娜等[6]采用超临界CO2萃取锁阳中黄酮类化合物，萃取率为21.18%，但该法存在使用设备压力较高，设备投资费用和维护费用昂贵等缺陷；俞发荣等[7]发现锁阳黄酮能增加大鼠运动耐力，提高机体抗氧化和抗疲劳能力，其机制与锁阳黄酮清除自由基、抑制单胺氧化酶(MAO)活性、提高神经兴奋性和机体免疫功能有关.锁阳黄酮作为中药药剂的有效成分之一，其提取工艺及其动力学在药剂生产中具有关键作用.目前，有关中药有效成分动力学模型的研究较多，如李有润等[8]、储茂泉等[9]在非稳态理论、膜理论等方面作了有益探讨.

本试验采用甘肃瓜州8月份采收锁阳为材料，通过单因素试验和正交试验优化超声波辅助提取锁阳黄酮的工艺条件，并依据菲克第一定律建立锁阳黄酮传质动力学模型，以期进一步完善锁阳黄酮提取动力学的基础研究，为锁阳中有效成分深加工，完善超声波辅助提取中药材有效成分机制提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

锁阳，由甘肃省微藻工程研究中心提供，为干燥的肉质茎，经晾干，粉碎，过筛后密封保存.722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；XO-SM50型超声波微波组合反应系统，南京先欧仪器制造有限公司；CR-21高速离心机，日本日立公司.芦丁标准品(纯度(99%)购自成都德思特生物技术有限公司(批号：100080-200306)；无水乙醇、Al(NO3)3、NaOH、NaNO2均为分析纯，天津百世化工有限公司.

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的制作 将芦丁于120 ℃烘箱中烘至恒重，于干燥器中冷却后称取0.106 15 g，用70%乙醇溶解，定容至250 mL，得到浓度为0.246 mg/mL芦丁标准溶液.准确吸取一定量的芦丁标准溶液于10 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀放置6 min 后加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后加入4% NaOH溶液4 mL，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀，15 min后在波长510 nm处测定吸光度A，并以试剂作空白[5].以芦丁含量Y(mg)为纵坐标，以吸光度A为横坐标，作线性回归方程：

Y=0.802 568A+0.001 926(R2=0.999 2)

式中：Y为芦丁含量，A为吸光度.

1.2.2 锁阳中黄酮类化合物的提取方法 准确称取0.5 g锁阳，加入一定体积分数的乙醇25 mL，于超声波反应系统中，在一定功率下超声波辅助提取一定时间，2 000 r/min离心5 min，取上清液即为待测样液.

1.2.3 样品中黄酮类化合物的测定 吸取1 mL待测样液至10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，再吸取0.5 mL稀释液于10 mL容量瓶中，按照测定芦丁标准液吸光度的有关步骤进行操作，测定吸光度A，计算样品中黄酮类化合物的提取得率.样品中黄酮得率按下列公式计算：

式中：Y为根据回归方程计算得到的芦丁含量，mg；V1为稀释液总体积，mL；V2为待测样液总体积，mL；V3为吸取待测样液体积，mL；V4为吸取稀释液体积，mL；m为锁阳样品质量，g.

1.2.4 单因素试验 参考孟敏等[10]的方法，分别设置乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)、提取时间(10、20、30、40、50 min)、料液比(g∶mL))(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 、超声波功率(195、260、325、390、455 W)，以黄酮类化合物提取得率为指标，固定3个因素，改变另一个因素，进行单因素试验，每个试验重复3次.

1.2.5 正交试验 根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数、料液比、超声波辅助提取时间与超声波辅助提取功率为因素(表1)，采用L9(34)正交试验设计.

表1 正交试验设计

1.2.6 与传统提取方法的比较 参照张勇等[5]方法，称取一定量锁阳粉末，按照1∶40 (g∶mL)比例加入体积分数为50%乙醇，在温度为80 ℃条件下回流提取1.5 h，按照1.2.3方法测定锁阳黄酮含量并计算其得率.

1.3 提取动力学试验

1.3.1 黄酮类化合物提取平衡浓度的确定 在乙醇体积分数为60%、料液比为1∶50 (g∶mL)、超声波辅助提取功率为390 W条件下，在某一恒定温度中进行超声波辅助提取锁阳黄酮类化合物，每隔5 min测定样液中黄酮类化合物的浓度，直至样液中黄酮类化合物的浓度为某一恒定值，该浓度即为提取平衡浓度.

1.3.2 不同超声温度下提取平衡浓度的确定 分别在超声温度为303.15、313.15、323.15、333.15 K下，按1.3.1中的方法确定不同超声温度下的锁阳黄酮类化合物的提取平衡浓度.

1.4 数据处理

单因素和正交设计试验数据采用Excel 2003和DPS 6.55软件处理，3次重复，取平均值.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响 乙醇体积分数是影响黄酮类化合物提取得率重要因素之一.在超声时间为30 min、料液比为1∶50 (g∶mL)、超声波辅助提取功率为325 W条件下，研究乙醇体积分数对锁阳黄酮提取得率的影响，结果见图1.

由图1可知，随乙醇体积分数的逐渐增加，锁阳黄酮提取得率呈上升趋势；当乙醇体积分数为60%时，提取得率达到最大值(176.08 mg/g)，之后黄酮提取得率随乙醇浓度升高趋于稳定，但差异不显著(P>0.05).原因可能是乙醇体积分数较低时，水分子较多，使细胞膜溶胀导致离子通道受阻[11]，黄酮无法从细胞内出来；乙醇体积分数为60%时，提取液极性和黄酮类化合物极性相当，其提取得率最大；当乙醇体积分数超过60%时，其极性发生改变[12]，与黄酮类物质的溶出不再呈线性关系，且提取液颜色明显加深，说明锁阳中其他有效成分也被提取出来，给后序分离纯化带来难度，因此确定乙醇体积分数以60%为宜.

图1 乙醇体积分数对提取率的影响Figure 1 The effect of ethanol concentration on the extraction yield

2.1.2 超声波辅助提取时间对黄酮得率的影响 在乙醇体积分数为60%、料液比为1∶50(g∶mL)、超声波辅助提取功率为325 W条件下，超声波辅助提取时间对锁阳黄酮提取得率的影响，结果见图2.

由图2可知，当提取时间在10～30 min范围内，锁阳黄酮提取得率呈现逐渐升高的趋势；当提取时间为30 min时，提取得率达到最大值；继续延长提取时间，提取得率基本趋于稳定.其原因可能是超声时间延长，由于超声波空穴和机械作用，利于提取液渗透进入组织细胞内部，有助于加速有效成分的溶出过程，增加了黄酮在提取液中的含量[13]；当达到一定程度后，组织细胞内黄酮提取完全.因此，确定提取时间为30 min.

图2 超声提取时间对锁阳黄酮提取得率的影响Figure 2 The effect of ultrasonic time on extraction yield

2.1.3 提取料液比对黄酮得率的影响 在乙醇体积分数为60%、超声波辅助提取时间为30 min、超声波辅助提取功率为325 W条件下，料液比对锁阳黄酮提取得率的影响.

由图3可知，锁阳黄酮提取得率随着料液比逐渐增加，呈现先增加后趋于稳定的趋势，当料液比为1∶50(g∶mL)时，提取得率达到最大值，为213 mg/g；原因主要为料液比增加后，提高了植物组织细胞的溶胀性，增加了溶剂和植物材料的接触面积[14]，同时植物组织内部和外部提取浓度差变大，促使黄酮类化合物向乙醇溶剂扩散，使锁阳中黄酮类物质的残留量减少，因此提取得率增大；但是随着溶剂量增加至料液比为1∶50以后时，黄酮提取得率基本不变化，所需试剂量增加，导致成本增加[11].考虑到试剂的回收和节约能耗资源，故料液比以1∶50 (g∶mL)为宜.

图3 料液比对锁阳黄酮提取得率的影响Figure 3 The effect of soil-liquid ration on extraction yield

2.1.4 超声波辅助提取功率对黄酮得率的影响 在乙醇体积分数为60%、料液比为1∶50 (g∶mL)、超声波辅助提取时间为30 min条件下，超声波辅助提取功率对锁阳黄酮提取得率的影响.

由图4可知，超声波功率为195～390 W时，随着超声波功率增大，黄酮得率提高，这是由于超声波功率增大，空穴作用和机械作用强烈，产生冲击波压力增加，引起粘滞性漩涡对锁阳组织细胞形成了剪切应力，促使内部液体流动，细胞破裂程度高，增加了黄酮在提取液中溶解性，且超声波功率为390 W时，得率达到最高；而超过390 W后，黄酮得率逐渐下降，主要是温度急剧上升，影响黄酮稳定性.因此确定超声波辅助提取功率为390 W.

图4 超声功率对锁阳黄酮提取得率的影响Figure 4 The effect of ultrasonic power on extraction yield

2.2 正交试验结果分析

综合表2～3可以看出：影响黄酮提取得率的各因素水平按强弱顺序排列：A1>A2>A3，B1>B2>B3，C3>C2>C1，D2>D3>D1.由表2的极差分析结果可以看出，RA>RB>RC>RD，因此，4个因素对锁阳黄酮提取得率的影响大小依次为：乙醇体积分数(A)>超声时间(B)>料液比(C)>超声功率(D).在正交试验中，因为D项(超声功率)均方最小，为0.640，即选D项作为误差项.由表3可知乙醇体积分数、超声时间对锁阳黄酮提取得率的影响极显著(P<0.01)，料液比对其总黄酮提取得率的影响显著(P<0.05)，超声功率对提取得率的影响不显著(P>0.05).综合以上分析，超声波辅助提取锁阳黄酮的最佳因素水平为A1B1C3D2，即乙醇体积分数为60%，超声时间为30 min，料液比为1∶50(g∶mL)，超声功率为325 W.

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析结果

** 极显著(P<0.01)；*显著(P<0.05).

2.2.1 最佳工艺条件验证试验 由表4可知，按A1B1C3D2条件进行3次平行试验，锁阳黄酮的提取得率平均值为238.68 mg/g，高于表2中所有试验结果，故A1B1C3D2为最佳提取工艺条件.

2.3 与传统方法比较研究

由表4可知，本方法和传统醇提法对锁阳黄酮提取得率分别为238.68 mg/g和208.13 mg/g，说明超声法辅助提取法优于传统醇提法，得率较高，且提取时间短.

2.4 提取动力学试验结果分析

2.4.1 黄酮提取过程分析 锁阳黄酮的提取过程是黄酮(溶质)从锁阳颗粒组织内部(固相)向溶液(液相)进行扩散的两相间传质过程.根据质量守恒的原理，从锁阳颗粒中溶出的黄酮等于主体溶液中增加的部分，溶液中黄酮浓度的变化可看作是各微观变化的综合反映.故可通过溶液中黄酮浓度的变化来描述复杂的提取过程[15].

表4 不同提取方法对黄酮提取得率的比较研究

2.4.2 黄酮提取过程中的动力学模型 溶质在固液两相之间的浓度差是提取过程中扩散传质的推动力.主体溶液中黄酮浓度的变化与平衡浓度和溶液浓度之差符合动力学方程：

(1)

式中，V为溶液体积(mL)；C为溶液中黄酮质量浓度(mg/mL )；t为提取时间(min)；k为总传质系数[mL/(m2·min)]；S为总传质面积(m2)；C∞为溶液中黄酮平衡浓度(mg/mL).令kS/V=kobs,可得：

(2)

式中，kobs为提取过程的表观速率常数，与物料结构、溶质的性质及操作条件有关.黄酮提取时，物料未经过预浸泡，则初始条件为t=0时，C=0.对式(2)进行积分并整理，可得：

C=C∞[1-exp(-kobst)]

(3)

式(3)即为描述溶液中黄酮浓度随时间变化的方程.

2.4.3 黄酮平衡浓度的确定 平衡浓度与溶剂组成、液固比及提取温度等因素有关.研究表明，锁阳黄酮提取过程中，温度对平衡浓度的影响较大[5].当提取条件确定后，黄酮的平衡浓度是一个常数.

图5中黄酮平衡浓度随温度升高而增大，且温度越高，达到提取平衡所需的时间越短.在锁阳内部，黄酮在溶剂中的溶解度随温度升高而增大，溶出量增多，提取平衡向右移动，表现为平衡浓度增大.温度升高，分子运动加快，溶剂对细胞组织的渗透作用增强，扩散及溶质溶解的速度也随之增加.高温使质量传递过程加快，黄酮在锁阳表面的脱附作用增强，达到平衡的时间缩短.

对不同温度下的平衡浓度C∞数据进行整理，得试验条件下平衡浓度随温度的变化规律为(图6)：

C∞=0.617 6exp(0.006 3T)

2.4.4 动力学模型验证 将式(3)变形：

(4)

图5 不同温度下锁阳黄酮浓度与时间的关系Figure 5 Relationship between concentration of flavonoids in liquid phase and extraction time under different temperatures

图6 平衡浓度与温度的关系Figure 6 Relationship between balance concentration and temperature

根据不同温度下浓度随时间变化的关系数据，以ln[C∞/(C∞-C)]对t作图(图6)，并进行线性回归分析，直线的斜率即为kobs.

由图7可以看出，数据拟合结果有较好的线性关系，且随温度升高，表观速率常数增大.表明温度越高，提取进程越快，该结论与试验结果相符.说明式(3)能够较准确地描述锁阳黄酮的提取过程.

2.4.5 动力学方程常数的确定 通常情况下，速率常数与温度的关系符合Arrhenius方程，即：

kobs=k0exp(-Ea/RT)

(5)

式中，k0为指前因子(min-1)；Ea为表观活化能(J/mol)；R为气体常数(8.314 J/mol·K)；T为绝对温度(K).将式(5)两边取自然对数并整理得：

(6)

以lnkobs对1/T作图，得一条直线，斜率为-Ea/R，

图7 ln[C∞/(C∞-C)]关系曲线Figure 7 Relationship between ln[C∞/(C∞-C)〗 and time

截距为lnk0，由此可计算出k0和Ea.

由图8可知，Ea/R=1346.4，lnk0=1.945 7，则Ea=1.119 3×104J/mol，k0=6.998 5 min-1.代入(5)式，得：

(7)

将(4)和(7)代入(3)得：

C=0.6176exp(0.0063T)

(8)

式(8)即为试验条件下锁阳黄酮提取的动力学方程.

图8 ln kobs与1/T的关系Figure 8 Relationship between ln kobs and 1/T

3 讨论

为探讨超声波辅助提取锁阳中黄酮类化合物及其动力学，本研究采用单因素和正交试验考察了乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率等4种因素对锁阳黄酮类化合物提取效果的影响，结果表明乙醇体积分数、超声时间对锁阳黄酮提取得率的影响极显著，此结果与武传芹等[16]的试验结果类似，说明当锁阳植物细胞处于乙醇组成的溶剂环境中时，超声波空穴作用可促进有机溶剂穿透植物组织，利于有效成分溶解；同时超声波加速介质质点运动过程，使有效成分获得较高的加速度和动能，脱离原材料溶解于有机溶剂中，被有机溶剂“捕捉”.超声功率对锁阳黄酮提取得率的影响不显著，在一定范围内时，对锁阳黄酮提取得率的影响呈正相关性，此结果与杨萌萌等[17]的研究结果一致.超声功率的增加会导致热效应、空穴效应等加强，细胞内黄酮类化合物溶出和扩散速率增加，使其得率明显提高.

在提取锁阳黄酮类化合物效果和时间上，超声波辅助提取得率大约是传统醇提方法的1.15倍，比传统醇提方法时间缩短两倍以上.超声波辅助提取技术可解决现有单一技术的缺陷，该法具有耗时短，提取率较高，相比于传统工艺具有一定的优势.随着超声波技术的不断进步和完善，必将在天然产物有效成分提取领域发挥更大的作用.但本试验中未考虑超声频率对黄酮提取得率的影响，超声波对锁阳黄酮结构是否造成破坏，有待后续试验进一步研究和验证.

通过对提取动力学进行传质分析，说明锁阳黄酮提取是一个非常复杂的过程，提取条件和物料本身的特性均可能对其产生较大影响.从质量守恒原理出发，提取过程中黄酮在固液两相间转移的部分质量不变，以溶液中黄酮含量的变化反映复杂的黄酮溶出过程，并在此基础上建立了提取动力学模型.该模型能够较好地描述锁阳黄酮的提取过程，符合扩散传质的动力学规律.

4 结论

1) 本研究通过单因素和正交试验设计，确定了超声波辅助提取锁阳黄酮最佳工艺条件为：乙醇体积分数为60%，超声时间为30 min，料液比为1∶50(g∶mL)，超声功率为325 W，此时黄酮提取得率可达238.68 mg/g.

2) 该法优于传统醇提法，提取时间缩短.

3) 运用Arrhenius方程求出提取过程中重要的动力学参数，其表观活化能为1.119 3×104J/mol，指前因子为6.998 5 min-1，动力学方程为：

C=0.617 6exp(0.006 3T)

该模型能够较准确地描述锁阳黄酮的提取过程.