低温弱光对红芸豆幼苗生长及生理生化特性的影响

何晓童，王盛祥，王玉萍

(甘肃农业大学园艺学院，甘肃兰州 730070)

植物的生长发育易受诸多环境因素的影响，其中，温度和光照较为显著.研究表明低温是制约植物生长发育的重要环境因素之一， 0 ℃以上的低温会导致冷害[1]，弱光直接影响着植物的净光合速率[2].研究发现，低温弱光是冬春保护地栽培中影响农作物正常生长发育和高产的重要障碍因素，是农业生产中经常遇到的恶劣环境条件，成为限制蔬菜产量和质量的重要因素[3].

芸豆(PhaseolusvulgarisL.)又名菜豆、棒豆及四季豆等，原产美洲的墨西哥和阿根廷，我国以华北、东北和西北栽培较多.红芸豆为蝶形花科菜豆属一年生草本植物，适应范围广，籽粒营养丰富，是补充植物蛋白的重要豆类蔬菜作物.红芸豆在气温低于10 ℃时易受冻，其适宜生长繁殖温度为18～20 ℃，喜光，是短日照异花授粉作物[4].由于生育期短、适应性广等特点，发展红芸豆优质高产化的种植已成为贫困山区农民的致富的一个产业支柱.为了适应市场需求，冬春季温室栽培红芸豆是个很好的种植方式，但冬春季温室栽培常常伴有低温弱光，对其生长和产量造成影响[5].

低温胁迫下，植物体内会产生大量活性氧(ROS)，直接对细胞造成伤害[6],能引发植物抗氧化酶系和光合代谢等方面的改变[7].植物体内存在多种抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等以及一些小分子的非酶抗氧化剂，都参与了抗逆过程[8-9].低温弱光也会影响叶绿素的含量，而叶绿素是植物转换和利用光能的关键色素.叶绿素荧光参数被视为研究植物光合作用与环境关系的内在探针.其中，最大光化学效率(Fv/Fm)是反映光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光量子效率的重要参数，其提供了线性电子传递速率的测定方法.因此能反映植物光合能力的大小，并判定环境胁迫对光合机构的影响程度.

弱光坏境会影响植物的光形态建成，从而削弱光合有效辐射强度或引起光质的改变[10].通常弱光处理下植物叶片厚度减小、叶色变浅、叶面积增加等现象[11].并且弱光环境下，植物光合速率受到直接影响，同时也受温度，湿度，CO2浓度和品种自身差异共同作用的影响.另外，弱光胁迫会使植物细胞内透性增大、电解质外渗、活性氧代谢失衡、引发膜脂过氧化反应，造成细胞膜系统和代谢过程的损伤[12].

目前国内外关于红芸豆的研究主要集中在种植密度、种植方式及贮藏等方面[13]，而低温弱光胁迫对红芸豆生长及生理特性的影响方面研究较少.在冬春温室条件下，低温时常伴随着弱光[14]，研究低温逆境的试验结果中有弱光因素起作用，有研究发现低温下的弱光在一定程度上减弱了光合作用及相关酶活性的降低，保护了光合系统的稳定，维系了植物的正常光合能力[15]，所以了解蔬菜植物对低温弱光互作反应十分必要.本试验研究了低温弱光对2个品种红芸豆幼苗生长及相关生理指标的影响，比较了2个不同品种的耐性强弱，以期为进一步开展菜豆耐低温弱光生理与菜豆抗冷性育种及高产栽培提供一定的理论依据,以解决西北和东北地区冬春季温室栽培受低温弱光的影响提供一定的理论指导.

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验以‘英国大红芸豆’和‘小红芸豆’2个品种为材料，取饱满种子在播种前晾晒1 d，然后播种在装有育苗营养土的小花盆中.正常光温管理，昼夜温度25 ℃/18 ℃，光周期12 h/12 h(昼/夜)，光照强度200 μmol/(m2·s).播种16 d后待幼苗长至3叶1心时挑选生长健壮且长势一致的幼苗转移至人工气候箱中进行低温弱光处理.试验设4个处理，L-CK：英国大红芸豆昼夜温度25 ℃/18 ℃，光照强度200 μmol/(m2·s)，光周期12 h/12 h(昼/夜).S-CK：‘小红芸豆’昼夜温度25 ℃/18 ℃，光照强度200 μmol/(m2·s)光周期12 h/12 h(昼/夜).L-T：大红芸豆昼夜温度15 ℃/10 ℃，光照强度60 μmol/(m2·s)光周期12 h/12 h(昼/夜).S-T：‘小红芸豆’昼夜温度15 ℃/10 ℃，光照强度60 μmol/(m2·s)光周期12 h/12 h(昼/夜).处理组和对照组除温度和光照不同外其他生长环境均相同，处理7 d后，把幼苗从低温弱光移至正常温光下(昼夜温度25 ℃/18 ℃，光及温度周期12 h/12 h(昼/夜)，光照强度200 μmol/(m2·s))进行恢复1 d、2 d、3 d.在处理和恢复期间分别取第2、3展开叶测定株高、茎粗、叶面积、过氧化氢酶(catalase,CAT),过氧化物酶(peroxidase,POD),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2),丙二醛(malonaldehyde,MDA)，谷胱甘肽(glutathione,GSH)，抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)，超氧阴离子(superoxide anion,O2-)、叶绿素含量以及叶绿素荧光参数Fv/Fm.每处理90盆，每盆3株，重复3次.

1.2 测定指标与方法

1.2.1 抗氧化物质及抗氧化酶 参照李合生[16]的方法，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定；SOD活性采用NBT还原法测定；POD活性采用愈创木酚法；过氧化氢酶采用直接比色法；超氧阴离子采用萘胺法.过氧化氢、GSH、APX采用南京建成的试剂盒测定.

1.2.2 叶绿素含量 用丙酮乙醇混合液法提取，用紫外可见分光光度计(DR/5000型)测定.

1.2.3 叶绿素荧光参数 采用英国Hansatech 公司生产的 FMS-2 型调制式叶绿素荧光仪测定.

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 低温弱光胁迫对幼苗生长的影响

表1结果显示：低温弱光胁迫下，‘英国大红芸豆’株高在3，5，7 d分别比对照降低2.5%、4.6%和13.2%；在恢复1，2，3 d后分别比对照降低12.8%、13.5%、12.2%；处理7 d生长抑制达到显著水平(P<0.05)，在胁迫解除后恢复速率逐渐增大.‘小红芸豆’株高在处理7 d比对照降低19%，在恢复3 d低于对照21%.茎粗的变化趋势与株高相同，‘英国大红芸豆’幼苗茎粗在处理3、5、7 d分别比对照显著降低4.7%、11.3%和16%，恢复1、2、3 d时分别比对照降低21%、21.%和17%，‘小红芸豆’幼苗茎粗在处理3、5、7 d分别比对照显著降低8%、12%和18%，在恢复3 d比对照降低15%，低温弱光胁迫对‘小红芸豆’茎粗的抑制比英国大红芸豆显著，且在恢复过程中，英国大红芸豆的茎粗变化显著高于‘小红芸豆’.‘英国大红芸豆’幼苗叶面积在处理3、5、7 d时，分别比对照显著降低10%、10.2%和13%、而‘小红芸豆’分别比对照显著降低8%、9%、15%.胁迫处理对英国大红芸豆叶面积的抑制作用没有‘小红芸豆’显著，而且在恢复过程中，叶面积增大速率也较‘小红芸豆’快.

表1 低温弱光胁迫及恢复对红芸豆幼苗生长指标的影响

同行不同字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05).S、L分别代表‘小红芸豆’、英国大红芸豆2个品种，CK表对照，T表低温弱光处理.

Different letters in the same trade indicate that there is significant difference between different treatments of the same variety (P<0.05).S and L respectively represent two varieties ofS.sinensisandS.vulgaris,CK table,and T-table low-temperature and low-light treatment.

2.2 低温弱光胁迫对红芸豆叶绿素含量及叶绿素荧光参数的影响

低温弱光胁迫下，‘小红芸豆’幼苗叶片中叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)和总叶绿素均呈下降趋势，下降幅度随着胁迫时间的延长不断增大(图1).英国大红芸豆叶绿素a在处理3、5、7 d分别比处理前降低3.4%、10%和26%，处理7 d达最低值，在恢复3 d含量接近对照.‘小红芸豆’在处理3、5、7 d分别比对照降低6.8%、18%和31%，且在处理5 d、7 d与‘英国大红芸豆’差异显著，恢复速率较慢.叶绿素b变化趋势和叶绿素a变化趋势相同，‘英国大红芸豆’在处理7 d比对照降低42%，并达最低值，在恢复1、2、3 d分别比处理前降低34%、20%、4%，在恢复3 d与处理前无显著差异.相比‘英国大红芸豆’，‘小红芸豆’在胁迫下叶绿素b含量下降幅度更甚，在7 d比对照降低66%，恢复3 d比对照降低21%，恢复速率也较‘英国大红芸豆’慢.总叶绿素在低温弱光胁迫下呈下降趋势，在恢复过程有所提高，但相比‘英国大红芸豆’‘小红芸豆’在胁迫下下降幅度大，恢复速率慢，‘小红芸豆’在各个阶段，无论胁迫还是恢复过程中总叶绿素含量都显著低于‘英国大红芸豆’.

同色柱不同字母表示同一品种间不同处理差异显著(P<0.05)，S表示‘小红芸豆’，L表示大红芸豆，T表示低温弱光处理.Different letters on the same color column indicate significant differences between treatments in the same variety (P<0.05).S indicates small red kidney beans,L indicates red kidney beans,and T indicates low temperature and low light treatment.图1 低温弱光对红芸豆叶绿素及Fv/Fm的影响Figure 1 Effects of low temperature and weak light and recovery period on chlorophyll content and Fv/Fm of red kidney bean

低温下植物CO2同化受阻，电子传递链被过度还原，因而即使是在弱光胁迫下，也会产生过剩的光能，对光系统造成伤害[16].Fv/Fm为暗适应条件下PSⅡ的最大光学转换效率，表示将吸收的光能向PSⅡ转换的潜力，能反映植物的光抑制的程度大小.图1显示，‘英国大红芸豆’和‘小红芸豆’的Fv/Fm在低温弱光胁迫下均呈下降趋势，前者在处理3、5、7 d分别比对照降低7%、15%和26%，下降幅度随着胁迫时间的延长不断增大，且与处理前差异显著(P<0.05)，说明低温弱光对PSⅡ造成了光抑制，在恢复1、2、3 d时分别比处理前降低13%、6%和3%，在恢复后期与处理前无显著差异.‘小红芸豆’光抑制更为明显，在处理3、5、7 d分别比对照降低11%、24%和43%，下降幅度显著大于‘英国大红芸豆’，处理7 d达最低值，在恢复3 d后比对照降低7%，说明虽然受到光抑制，但胁迫没有对植物的光合机构造成不可逆的伤害，总体上，‘小红芸豆’的PSⅡ光抑制比‘英国大红芸豆’显著.

2.3 低温弱光胁迫对叶片超氧阴离子与过氧化氢和丙二醛含量的影响

从图2可以看出，低温弱光下两个红芸豆品种的丙二醛含量均呈上升趋势，其中‘英国大红芸豆’在处理3、5、7 d时，较对照分别升高4%、21%和36%，在处理7 d达最高值，差异显著(P<0.05)，在恢复过程中逐渐下降，与处理前无显著性差异(P<0.05).‘小红芸豆’在处理3、5、7 d后分别比处理前升高27%、33%和47%，在恢复过程中也逐渐下降，在恢复3 d比处理前升高23%，相比大红芸豆，‘小红芸豆’的丙二醛含量随时间延长积累速率显著较高.低温弱光处理下超氧阴离子的含量也不断升高，

同色柱不同字母表示同一品种间不同处理差异显著(P<0.05)，S表示‘小红芸豆’，L表示大红芸豆，T表示低温弱光处理.Different letters on the same color column indicate significant differences between treatments in the same variety (P<0.05).S indicates small red kidney beans,L indicates red kidney beans,and T indicates low temperature and low light treatment.图2 低温弱胁迫及恢复期大红芸豆丙二醛、过氧化氢、超氧阴离子变化Figure 2 Changes of malondialdehyde,superoxide anion,hydrogen peroxide,peroxidase in the leaves of red bean during low temperature and weak light stress and recovery period

‘英国大红芸豆’在7 d达最高值，比对照增大44%，在恢复过程中不断下降，但仍显著高于处理前.与‘英国大红芸豆’相比，‘小红芸豆’超氧阴离子含量增加幅度显著，在7 d达最高值，在恢复过程中缓慢下降，恢复3 d接近正常水平.在低温弱光胁迫下过氧化氢含量随着时间的延长不断升高，但‘英国大红芸豆’增大幅度显著低于‘小红芸豆’，后者在处理3、5、7 d分别比处理前升高25%、35%和53%，在7 d达到最高值，在恢复过程中缓慢下降，但较‘英国大红芸豆’恢复速率缓慢.

2.4 低温弱光胁迫对叶片抗氧化酶活性及GSH含量的影响

从图3可以看出，POD在低温弱光条件下呈先下降后升高的趋势，‘英国大红芸豆’在3 d、5d分别比处理前升高23%、25%，随着胁迫时间延长开始下降，在恢复1 d下降到最低值，并且与处理前差异显著，在恢复3 d接近处理前水平，‘小红芸豆’在3 d、5d虽然也呈升高趋势，但升高幅度显著小于‘英国大红芸豆’，在恢复1 d达最低值，与处理前差异显著，并且恢复速率较慢.SOD的变化趋势与POD的相同，在低温弱光条件下3个红芸豆品种均是先升高后下降，在处理5 d均达最高值，在处理7 d开始下降，在恢复1 d达最低值，与‘英国大红芸豆’相比，‘小红芸豆’的升高幅度较小，下降幅度较大，并且恢复速率较慢.CAT活性也呈现先升后降的趋势，在处理3 d达到最高，5 d开始下降，在恢复1 d达最低值，‘英国大红芸豆’处理3 dCAT活性比对照高28%，处理5 d较对照升高21%，在恢复1 d比对照降低24%，而‘小红芸豆’在处理3 d较对照升高22%，恢复1 d后达最低值，比对照显著降低31%，均显著低于‘英国大红芸豆’.在恢复过程中，‘英国大红芸豆’在恢复3 d接近处理前水平，而‘小红芸豆’恢复速率较慢.从图3看出，胁迫处理下随时间延长，APX活性一直呈下降趋势，处理7 d 2品种均达到最低值，与‘英国大红芸豆’，‘小红芸豆’的APX活性下降幅度更大.GSH含量的变化趋势与APX相同，‘小红芸豆’在处理7 d显著低于‘英国大红芸豆’，并且恢复速率较慢.

同色柱不同字母表示同一品种间不同处理差异显著(P<0.05)，S表示‘小红芸豆’，L表示大红芸豆，T表示低温弱光处理.Different letters on the same color column indicate significant differences between treatments in the same variety (P<0.05).S indicates small red kidney beans,L indicates red kidney beans,and T indicates low temperature and low light treatment.图3 低温弱光胁迫及恢复期大红芸豆SOD、GSH、APX、CAT、POD变化Figure 3 Changes of SOD,CAT,GSH,APX in the leaves of red kidney bean under low temperature and weak light stress and recovery period

3 讨论

植物的营养生长在很大程度上受到低温弱光的影响，低温弱光抑制了日光温室中茄子株高、茎粗、及叶片的生长[17].本试验发现，2个红芸豆品种在低温弱光胁迫下株高、茎粗、叶面积均受到了一定程度的抑制，且随着时间的延长抑制作用越显著，在胁迫处理7 d抑制作用尤为明显，比对照降低幅度更大.与‘小红芸豆’相比，胁迫条件下‘英国大红芸豆’幼苗的生长速率较‘小红芸豆’快，去除胁迫后恢复速率也快，说明低温弱光胁迫对‘小红芸豆’幼苗的伤害较严重，生长抑制作用更大.

低温弱光胁迫下氧自由基随着时间的延长会不断积累[18]，而ROS的产生被认为是细胞应激反应和防御途径的激活[19].本试验中，随低温弱光胁迫处理时间延长，丙二醛、过氧化氢及超氧阴离子含量呈不断升高的趋势,其中‘小红芸豆’的氧自由基(超氧阴离子、过氧化氢)上升幅度均比‘英国大红芸豆’大，丙二醛的积累和增幅也显著高于‘英国大红芸豆’，说明‘英国大红芸豆’较‘小红芸豆’的抗逆能力更强.SOD、POD、CAT、APX是植物体内最主要的抗氧化酶系，其活性变化可以反映植物的抗逆境胁迫能力[20].但对植物在低温弱光胁迫下主要抗氧化酶活性变化的研究结论存在差异，可能与植物种类及处理有关.有研究表明低温弱光胁迫下产生的氧自由基能诱导SOD、POD、CAT酶活性的增强[21]，刘伟等[22]研究发现，黄瓜幼苗在低温弱光胁迫初期SOD、POD、CAT活性先上升，随着胁迫时间的延长其活性逐渐下降.本试验研究得出SOD、POD、CAT活性在处理期间呈现先升后降的趋势，氧自由基的不断积累超过了植物自身清除能力，与刘伟的结论一致.也与周艳红[23]在黄瓜中的研究结论一致.在处理初期SOD、POD均在5d达到最高值，而CAT在3 d就达到最高值随后下降,说明CAT对低温弱光比较敏感.除了SOD、POD、CAT在低温弱光胁迫下有升高趋势，APX的活性和GSH含量都呈下降趋势，且下降幅度随处理时间延长不断增大，表明在低温弱光胁迫下降低了APX活性，随着氧自由基的不断积累抑制并破坏了APX及GSH的合成及结构，所以增幅不断增大，这与前人研究结果一致[24-26].说明植物抗氧化系统中，抗氧化酶和抗氧化物质在协同起作用.2个红芸豆品种的抗氧化酶及抗氧化物质变化趋势虽然相同，但变化幅度不同，在胁迫初期‘英国大红芸豆’的SOD、CAT、POD上升幅度均比‘小红芸豆’大，随处理时间延长，‘英国大红芸豆’的下降幅度也比‘小红芸豆’小，并且恢复速率也较快，‘小红芸豆’的APX及GSH在胁迫下下降幅度比‘英国大红芸豆’大，并且恢复速率较慢.说明在低温弱光胁迫下，‘英国大红芸豆’能保持较高的抗氧化酶及抗氧化物质的活性.

低温弱光胁迫下植物叶片叶绿素含量不仅直接关系着植物的光合同化过程，而且也是衡量植物耐低温弱光性的重要生理指标之一[27-29].本试验发现，低温弱光胁迫下红芸豆幼苗的叶绿素含量(Chla、Chlb、总叶绿素)均呈下降趋势，但‘小红芸豆’的下降幅度比‘英国大红芸豆’更显著，并且恢复速率较慢.叶绿素在光合作用中有吸收传递转换光能的作用，其含量的大小直接影响植物光合作用的强弱，由此可知在低温弱光胁迫下‘英国大红芸豆’比‘小红芸豆’有更好的捕获光能和利用光能的能力.光抑制是植物普遍存在的现象，发生光抑制时过剩的光能会对光合机构造成伤害，从而使Fv/Fm下降[30-32].本试验中低温弱光胁迫下红芸豆的Fv/Fm均呈下降趋势，并且随着胁迫时间的延长下降幅度不断增大，但‘小红芸豆’下降幅度更大，这与叶绿素含量下降的结果相一致.说明低温弱光对‘小红芸豆’的叶绿素含量及光合机构伤害较大，而对‘英国大红芸豆’则伤害较轻，并且恢复速率较快，表明后者具有较强的抗低温弱光的能力.

4 结论

综上所述，低温弱光胁迫会抑制红芸豆幼苗的生长，叶绿素含量降低.由于活性氧氧的积累诱导了红芸豆叶片中SOD、POD和CAT活性的升高，但随着胁迫处理时间的延长SOD、POD、CAT活性下降，而APX活性、GSH含量一直呈下降趋势，在恢复期间SOD、POD、CAT、APX的活性及GSH含量均逐渐上升，说明抗氧化酶和抗氧化物质协同清除自由基，并在恢复期间MDA、H2O2、O2-含量不断降低，短时低温弱光胁迫没有对红芸豆抗氧化系统造成不可逆伤害，‘英国大红芸豆’比‘小红芸豆’具有较强的抗氧化胁迫能力.低温弱光胁迫对‘小红芸豆’PSⅡ的光抑制作用更为显著，然而在恢复期间2个红芸豆品种均能恢复到接近正常水平，但‘小红芸豆’恢复速率较慢，说明低温弱光胁迫没有对红芸豆光合机构及叶绿素合成造成不可逆伤害.‘英国大红芸豆’比‘小红芸豆’具有更强的抗低温弱光的能力，日光温室栽培建议选用‘英国大红芸豆’作为栽培品种，并且在连绵阴雨天气或冬春季时，应在7 d时及时补光增温，否则造成更严重的伤害甚至死亡.