压力性尿失禁大鼠中环氧合酶2表达的变化及意义

李 江，杨智明，柯 建，Prashant Mishra，罗 伟，刘 上，刘建和，袁志伟，孙 浩，杨昭庆，方克伟

0 引 言

压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指在活动、咳嗽或打喷嚏等腹压升高时尿液不自主流出，60岁以上妇女中发病率高达8.0%［1-2］。SUI手术治疗有较好的效果［3］，但关于SUI发病的分子机制研究较少。关于SUI发病机制研究有TGF信号传导相关的Smad2，胶原蛋白降解相关的基质金属蛋白酶［4］，炎症反应相关的细胞趋化因子［5］，抑制平滑肌的G蛋白信号调节因子2［3］等方面。而环氧合酶 2（Epoxygenase 2，COX⁃2）与 SUI的关系报道较少。

COX⁃2是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶，前列腺素几乎在所有下尿路组织中均有表达。COX⁃2已被证明直接参与了间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征［6］、膀胱过度活动症［7］、神经源性逼尿肌过度活动［7］等疾病过程，导致了尿频、尿急、流出道阻力下降等症状。截止2018年8月26日，COX⁃2在SUI阴道、尿道的表达变化未见报道，与SUI的关联尚不清楚［8］。经阴道分娩和雌激素下降被认为是SUI重要的诱因，但雌激素下降对SUI患者尿道中COX⁃2表达的影响仍不清楚。本研究将检测COX⁃2在SUI大鼠模型中的尿道、阴道、尿道平滑肌中的表达变化，并推测雌激素对COX⁃2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料健康雌性未育SD大鼠60只，雄性SD大鼠15只，4周龄，体重230～280g，平均（255±25）g，由昆明医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（滇）K2015⁃0002。雌雄大鼠4∶1合笼，自然妊娠，取分娩后18只雌性大鼠用于后面实验研究。COX⁃2抗体（（D5H5）XP® Rabbit mAb，CellSignal⁃ingCST公司）；β⁃Tubulin抗体（（9F3）Rabbit mAb，美国CellSignalingCST公司）；二抗（Antibody To Rabbit IgG（H+L）Peroxidase⁃Labeled，KPL公司）。

1.2 动物模型建立参考Lin等［9］的建模方式利用扩张阴道（单纯扩张组）、扩张阴道+切除卵巢（扩张＋切除组）2种方式建立SUI模型，另使用正常妊娠分娩后大鼠为对照组，共3组，每组6只。

1.3 动物模型验证

1.3.1 尿动力学检查单纯扩张组、扩张+切除组、对照组大鼠分别用尿动力检查仪（Laborie TUB500，加拿大）测最大膀胱容量（maximum bladder capaci⁃ty，MBC）和腹压漏尿点压（abdominal leak point pres⁃sure，ALPP）。具体方法参照文献［9］进行改进，在斑马导丝引导下将硬膜外导管自尿道口插人膀胱，插人约3 cm。硬膜外导管通过三通管与尿流动力学检测仪及微量输液泵相连进行测量。测量并记录MBC、ALPP。

1.3.2 喷嚏实验利用SD大鼠鼠须伸入鼻腔内，诱发其打喷嚏，打喷嚏时有尿液流出为阳性，反之则为阴性。

1.4 组织标本获取与保存每组随机挑选6只大鼠，处死后完整取出其尿道、阴道。每个标本分别加入4%中性甲醛固定液和RNAlater保存液，均保存于-80℃冰箱。

1.5 COX⁃2 mRNA水平表达检测取100 mg组织加入液氮研磨成粉末，使用总RNA提取试剂盒进行 RNA 提取，利用 PrimeScript RT reagent Kit（TA⁃KARA，中国）反转录得到cDNA。设计引物序列为：上游引物5 ⁃CTGTTCCAACCCATGTCAAAACC⁃3’，下游引物5’⁃GTACAGTTTTCACCGTAGAATCCA⁃3’。利用SYBR荧光定量试剂盒（TAKARA，中国）进行检测。

1.6 COX⁃2蛋白水平表达检测取组织液氮下研磨，使用RIPA裂解液和超声细胞破碎机裂解组织及细胞，12 000转/min、离心半径10 cm，离心10 min后取上清液，BCA法测定总蛋白浓度，利用Western blot法以β⁃tubulin作为内参进行COX⁃2蛋白检测及组间比较。

1.7 COX⁃2免疫组化分析每只大鼠分别取尿道、阴道分别做石蜡切片，使用COX⁃2行免疫组化，并参照文献［9］的免疫组化半定量法对染色实验结果进行判定。

1.8 统计学分析采用SPSS19.0软件进行数据分析。计量资料采用均数和标准差（±s）描述，多组间均值的比较采用方差分析，两两组间比较采用LSD法；计数资料采用频数描述，组间比较采用χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 喷嚏实验及尿动力学检查结果扩张+切除组阳性率（18/20，90%）明显高于单纯扩张组（12/20，60%）及对照组（0%），差异有统计学意义（P＜0.05）。3个组MBC差异无统计学差异（P＞0.05）。扩张+切除组、单纯扩张组ALPP较对照组明显下降，扩张+切除组较单纯扩张组明显下降（P＜0.05），见表1。

表1 SD大鼠尿动力检查结果（±s）Table 1 Results of urodynamic examination in SD rats（±s）

表1 SD大鼠尿动力检查结果（±s）Table 1 Results of urodynamic examination in SD rats（±s）

1 cmH2O=0.98kPa与对照组比较，*P ＜0.05；与单纯扩张组比较，＃ P ＜0.05

组别对照组单纯扩张组扩张+切除组n 6 6 6最大膀胱容积（mL）2.82±0.40 2.77±0.49 2.78±0.39漏尿点压（cmH2O）64.85±2.44 45.20±2.78 44.75±2.33*＃

2.2 COX⁃2 mRNA及蛋白的表达荧光定量PCR及Western blot检测结果显示，单纯扩张组、扩张+切除组 COX⁃2mRNA 表达［（1.400±0.074）、（1.750±0.098）］、蛋白的相对表 达量［（1.640±0.045）、（1.950 ± 0.077）］较对 照 组［（1.00 ± 0.16）、（0.77±0.26）］明显升高（P＜0.001）；扩张+切除组较单纯扩张组明显升高（P＜0.05）。见图1。

图1 Western blot检测SD大鼠COX⁃2蛋白水平的表达Figure 1 Expression of COX⁃2 protein level by western blot

2.3 COX⁃2免疫组化结果COX⁃2在尿道上皮组织表达未见明显变化，对照组、单纯扩张组、扩张+切除组染色强度表达积分分别为 1.00±0.89、1.16±0.75、1.00±0.63，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。阴道组织中，COX⁃2主要表达在上皮细胞质，对照组、单纯扩张组、扩张+切除组COX⁃2的染色强度表达积分分别为0.50±0.54、5.55±0.54、9.33±0.81，组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。尿道平滑肌组织，COX⁃2主要表达在平滑肌细胞质，对照组、单纯扩张组、扩张+切除组染色强度表达分别为0.66±0.51、5.33±0.51、8.50±0.54，组间两两比较差异均有统计学差异（P＜0.05）。见图4。

图2 SD大鼠COX⁃2尿道上皮组织中的免疫组化表达Figure 2 Immunohistochemical expression of COX2 in vaginal tissues of three groups of SD rats

图3 SD大鼠COX⁃2阴道组织中的免疫组化表达Figure 3 Immunohistochemical expression of COX2 in vaginal tissues of three groups of SD rats

图4 SD大鼠COX⁃2在尿道平滑肌组织中的免疫组化表达Figure 4 Immunohistochemical expression of COX2 in urethral smooth muscle of SD rats

3 讨 论

产伤与雌激素下降被认为是SUI的主要诱因。在经历妊娠和阴道分娩的女性中约1/3遭受过尿失禁。本研究利用扩张阴道和切除卵巢建立SUI动物模型来模拟这2种疾病诱因。单纯扩张组和扩张+切除组ALPP较对照组降低，而MBC却无明显差别，表现为流出道阻力下降为主，根据Dokmeci等［10］可确定尿失禁的类型。

目前尚无COX⁃2在SUI中表达变化的直接证据。de Jongh等［11］在离体的膀胱的上皮层、粘膜层、肌层的细胞核中发现有COX⁃2的表达。也有报道COX⁃2在细胞核外表达［12］。本研究阴道和尿道肌层的COX⁃2主要表达于细胞浆中。COX⁃2在3组尿道上皮中表达无明显变化。与之相似，Marentette等［5］发现COX⁃2在正常人的已分化的尿路上皮细胞内表达升高，而在IC/PBS患者的尿路上皮细胞则未见COX⁃2表达。COX⁃2已证实对上皮细胞有保护作用［13］。这些数据提示了COX⁃2在上皮细胞的表达与分化阶段、病理状态有关。

COX⁃2在尿道平滑肌层中的表达变化与下尿路症状有关。Comeglio等［14］发现COX⁃2在慢性前列腺炎患者的尿道平滑肌层受到炎症因子的诱导表达升高。膀胱过度活动症患者的膀胱粘膜层及平滑肌层COX⁃2的表达升高［15］，而COX⁃2抑制剂灌注可改善膀胱过度活动症患者的症状［16］。间质细胞广泛位于下尿路的平滑肌层并参与调节平滑肌的收缩。Hashitani等［17］发现间质细胞通过COX⁃2的活性和表达来调节肌肉自发的电活动。本研究中同样观察到COX⁃2在SUI模型的平滑肌层中表达升高。COX⁃2与平滑肌的收缩相关，而尿道的闭合压力能提供主要的尿道阻力。平滑肌中COX⁃2的表达变化可能与SUI发病机制相关。

雌激素已被证实与SUI的发病相关，血清雌激素下降，可出现尿道萎缩、阴道干涩瘙痒。本研究中扩张+切除组中COX⁃2在阴道及尿道平滑肌中的表达均高于单纯扩张组及对照组，可能是雌激素下降导致的结果。由于COX⁃2基因启动子含有雌激素结合位点，可上调内皮细胞COX⁃2的活性及促进前列腺素的生成。在其他组织中也观察到相似的情况，Murakami等［18］发现雌激素水平下降或绝经诱导子宫内膜息肉中COX⁃2的高表达。雌激素受体广泛分布于在膀胱三角区、尿道上皮和固有层、平滑肌层、阴道粘膜，肛提肌等组织的细胞核内。雌激素替代治疗特别是局部用药被认为是有效的SUI的治疗方式。已有学者发现雌激素下调了牛的软骨细胞和分泌型上皮细胞COX⁃2的表达。雌激素替代治疗改善SUI症状的同时有可能下调尿道阴道中COX⁃2的表达，这可能为这种治疗提供新的证据支持。

实验对象SD大鼠妊娠期盆底所承受的压力小于妇女，尿动力学检查时大鼠为麻醉状态，测量情况可能与受到影响［19］。但是，本研究进行了模型的验证，使动物模型尽量能够代表人类疾病过程。

综上所述，本研究显示SUI大鼠模型的阴道、尿道平滑肌中COX⁃2表达升高，尿道上皮无明显变化。切除卵巢后可能引起雌激素下降，导致SUI大鼠下尿道COX⁃2表达升高，COX⁃2表达的上调可能与SUI的发病机制相关。