利用常压室温等离子体诱变选育三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素产量差异菌株

谢录翰，康春婷，孙菊鲜，侯 婕，葛 欣

（河北大学生命科学学院，河北保定 071002）

β-胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，广泛应用于生物、医药、食品、化妆品等多种领域［1］。三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）是目前已知的β-胡萝卜素和番茄红素高产菌株，用生物发酵手段生产的类胡萝卜素较物理化学提取手段具有产量高、安全性强、生物活性完全和经济效益高等多种优点。特别值得注意的是，在三孢布拉氏霉菌的代谢途径中，番茄红素是生产β-胡萝卜素的前体物，番茄红素的生物学和营养学价值要更高于β-胡萝卜素，其具有消除人体自由基、预防衰老、抗癌抗肿瘤等多种功效［2-3］。

三孢布拉氏霉菌是一种单细胞多核生物体，菌丝体和孢子在传代和培养的过程中易退化。三孢布拉氏霉菌分为正（+）、负（-）2种单性菌株，负菌株是番茄红素生产菌株，正菌株在负菌的生长过程中主要提供三孢酸等性激素来刺激负菌株番茄红素的积累［4］。在单独培养正、负菌株时，番茄红素产量较低，绝大部分高产和低产菌株颜色差异不显著，其在初筛过程中根据菌丝颜色判断菌株产量差异较困难。因此，通过物理化学等诱变手段筛选产量差异菌株并建立一种较为高效的初筛手段对于三孢布拉氏霉菌菌株的选育具有重大意义。

目前，常规的诱变手段有紫外（UV）诱变、亚硝基胍（NTG）诱变、N+注入诱变和常压室温等离子体诱变（atmospheric and room temperature plasma，简称ARTP）等，由于三孢布拉氏霉菌是单细胞多核生物体，不同的诱变手段对孢子的诱变效率千差万别。Rodriguez等利用紫外线、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯（EMS）分别对B.trispora（+）和B.trispora（-）进行复合诱变，诱变后的负菌株在添加三孢酸的平板上生长，菌落颜色差异显著，以此作为番茄红素产量差异菌株初筛标准［5］。Mehta等通过NTG处理B.trispora孢子，经过接合培养方式培养，获得产量达39 mg/g的β-胡萝卜素的两性异核体以及番茄红素环化酶缺陷型菌株［6］。王强利用N+注入、ARTP和NTG等多种诱变处理方式诱变B.trispora，筛选出了3株高产番茄红素突变株，番茄红素产量为0.97 g/L，其高产菌株的hmg R、car RA、car B基因的表达水平对比野生型菌株显著提高［7］。

综合比较众多学者的多种诱变处理方式，发现ARTP和亚硝基胍的处理措施诱变效果最显著。由于亚硝基胍对环境造成污染以及对试验人员有致癌威胁，因此，ARTP诱变是较为安全高效的诱变措施。ARTP技术是采用氦气为工作气体的常压室温等离子体源，其中含有多种化学活性粒子成分，如OH、氮分子二正系统、氮分子一负系统、激发态氦原子、氢原子和氧原子等，使三孢布拉氏霉菌成熟孢子的DNA遗传物质损伤，生物体通过高容错的修复机制产生丰富的错配位点，进而引起突变［8］。

众多研究学者对三孢布拉氏霉菌诱变的研究都集中在筛选高产突变体，往往忽略了负突变菌株的价值。由于三孢布拉氏霉菌番茄红素代谢调控复杂，负突变菌株也能从侧面解析其代谢调控过程，所以，无论是正突变菌株还是负突变菌株，只要菌丝颜色与野生型存在差异均具有研究价值。

三孢布拉氏霉菌隶属于毛霉目（Mucorales）笄霉科（Choanephoraceae）布拉氏霉菌属（Blakeslea），其代谢途径如图1所示［9-11］。

在其复杂的代谢途径中，HMG-CoA还原酶是番茄红素合成过程中的限速酶。洛伐他汀是一种降血脂药物，可以抑制HMG-CoA还原酶的活性，从而降低胆固醇等的合成［12］。洛伐他汀平板能够增加突变效率，形成HMG-CoA还原酶基因突变菌株或HMG-CoA还原酶过表达菌株［7］。脱氧胆酸钠（SDC）可以抑制菌丝体的蔓延，易于突变菌株的计数和分离。因此，利用洛伐他汀和SDC的麦芽汁平板培养菌株，通过颜色差异即β-胡萝卜素产量差异初筛表型差异菌株，即为β-胡萝卜素产量差异菌株。

本研究旨在利用ARTP技术筛选菌丝颜色差异突变体，在洛伐他汀胁迫下筛选β-胡萝卜素产量差异菌株，高产菌株在工业方面具有较大利用价值，高、低产差异性菌株对于研究其生物代谢途径、探索色素合成的相关基因的表达调控具有潜在价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种及药品 三孢布拉氏霉菌NRRL 2896（-），由笔者所在实验室保存；洛伐他汀，购自黑龙江肇东华富药业有限责任公司；脱氧胆酸钠，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 仪器 ARTP诱变系统，购自北京思清源生物科技有限公司；SPX型生化培养箱，购自宁波东南仪器有限公司。

1.1.3 培养基 产孢培养基（PDA）：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂12 g/L，0.1% SDC。

诱变培养基：5°麦芽汁，12 g/L琼脂，0.1% SDC。

筛选培养基：5°麦芽汁，12 g/L琼脂，0.1% SDC，5 mg/L洛伐他汀。

1.2 试验方法

1.2.1 孢子悬液的制备与致死率的计算 将三孢布拉氏霉菌接种至产孢培养基，28℃培养3～4 d，收集孢子保藏并计数。将孢子悬液浓度调至106个/mL，取10μL孢子悬液涂于诱变的金属片上，处理时间分别为0、40、80、120、160、200、240 s，处理距离为2 mm，气体流量为10 L/min。将处理后的金属片转移至EP管中，加入1mL缓冲液，涡旋振荡2min，充分混合金属片中的孢子，吸取100μL涂布平板，每组重复2次。将涂布平板置于28℃培养箱培养2 d，观察孢子萌发和菌落生长状况，计数并计算致死率，致死率＝（对照菌落数-诱变菌落数）/对照菌落数×100%，并确定ARTP诱变时间。

1.2.2 颜色差异菌株的初筛与表型性状稳定性的鉴定 诱变菌株在含有5 mg/L洛伐他汀的筛选培养基上生长2 d，观察菌丝颜色差异，初筛出与未处理组有较大差异的菌株，划线筛选培养基平板，传代并纯化，收集孢子获得传代后的孢子液。将颜色差异菌株孢子和对照组涂布诱变培养基平板，生长2 d，待菌丝长出后同等条件下继续生长24～48 h，观察菌丝颜色变化，验证颜色差异菌株表型性状稳定性。

1.2.3 三孢布拉氏霉菌色素的提取与全波长扫描鉴定 色素提取方法参照文献［13］并稍作改动。接种三孢布拉氏霉菌置于含100 mL 5°麦芽汁的250 mL三角瓶中，在28℃培养箱以200 r/min转速条件下发酵5 d，纱布过滤得到菌丝体，无菌水洗涤3次。将菌丝体置于干燥箱，40℃烘干至恒质量，准确称取0.1 g菌丝于研钵中，加入0.5 g石英砂，在阴暗避光条件下，向研钵中加入乙酸乙酯充分研磨，将研磨破碎物转移至离心管中，用乙酸乙酯定容至10 mL，充分萃取至菌丝无色。吸取乙酸乙酯提取的色素，离心取上清，用乙酸乙酯作对照，测定色素提取物的全波长。

1.2.4 β-胡萝卜素标准曲线的制备与不同突变株色素产量测定 准确称量β-胡萝卜素10 mg，用少量三氯甲烷溶解，并用乙酸乙酯稀释定容至10 mL，取此液1 mL，稀释至100 mL，此时β-胡萝卜素的浓度为10 mg/L，即β-胡萝卜素标准液。吸取β-胡萝卜素标准液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，用乙酸乙酯定容至10 mL。在456 nm处测定吸光度，制备标准曲线。将发酵后的菌丝烘干，准确称取0.1 g菌丝体，充分研磨后用10 mL乙酸乙酯萃取，离心后吸取上清在456 nm处测定吸光度，根据标准曲线换算色素含量，色素含量定义为1 g干质量菌丝所含色素的质量（mg）。

2 结果与分析

2.1 诱变处理致死率

为了确定最优的ARTP诱变时间，对三孢布拉氏霉菌的孢子在同等条件下不同处理时间进行致死率计算，致死率曲线如图2所示。随着ARTP处理时间的延长，菌落存活数逐渐降低，致死率呈上升趋势，ARTP处理时间小于80 s时，其致死率大幅上升，处理时间在80～240 s之间时，致死率上升速度减缓，处理240 s时，致死率达到96%以上。结果表明，三孢布拉氏霉菌孢子的诱变时间选择在160～200 s最佳，此时致死率在90%左右，能够满足诱变条件，理论上可以获得最佳的诱变菌株。

2.2 诱变处理平板结果

经不同时间处理的孢子存活率存在差异，其诱变后生长情况如图3所示。经ARTP诱变处理后，孢子存活率明显下降，在处理时间为160～200 s时，100μL涂布诱变孢子液，平板上生长的菌落数较少。由于突变具有低概率性和偶然性，当菌落数较少时不利于突变体的筛选。因此，可以在诱变时适当增加涂布量以保证足够的诱变孢子存活，从而能够更好地满足筛选条件，获得更为理想的突变体。

2.3 颜色差异菌株性状表型

根据以上试验条件确定诱变处理时间，选择160、200 s 2个时间点作为诱变处理时间。突变体在含有洛伐他汀的平板上菌丝体呈现不同颜色，挑选的颜色差异突变株与野生型菌株置于同一平板上培养，观察菌丝颜色差异，其颜色差异情况如图4所示。洛伐他汀扩大了突变株的颜色差异，在含有洛伐他汀的诱变平板中，突变体大致呈现出4种颜色，分别为深黄色、黄色、浅黄色、白色；初筛的突变株在不含洛伐他汀的平板中，菌丝颜色与野生型菌株相比颜色差异明显，表现为深黄色、黄色、浅黄色、白色。

2.4 颜色差异菌株传代纯化

突变体由于自身基因的非特异性改变，部分菌株不能维持原有的色素产量，直观地表现为菌株颜色与筛选初期不一致。为保证突变菌株的稳定性，挑选多株突变菌株传代培养，经传代后部分菌株表型性状改变，挑选表型性状稳定菌株传代5次，复筛突变体，部分表型性状稳定菌株传代后如图5所示，颜色差异各组经纯化和传代后，菌落颜色差异明显，颜色表现为深黄色、黄色、浅黄色和白色等4种类别，其中深黄色的正突变菌株和白色的负突变菌株颜色差异明显。

2.5 颜色差异性菌株表型性状稳定性

为了验证颜色差异菌株表型性状稳定性，选取深黄色和白色2种类别菌株为代表进行持续培养，多时间段观察其表型变化，其结果如图6所示，A组为对照组，在平板上生长2 d后，对照组菌丝颜色呈暗黄色，持续生长24～48 h后颜色稳定；B组为深黄色突变株，生长2 d后菌丝颜色为深黄色，持续生长24 h后菌丝颜色加深，持续生长48 h后菌丝颜色与持续生长较24 h后菌丝颜色无明显差异；C组为白色菌株突变株，生长2 d后菌丝颜色为白色，持续生长24～48 h菌丝颜色仍为白色。

2.6 不同颜色突变株产孢能力差异性

为保存颜色差异突变株，在PDA平板上培养菌体使其产孢，获得可保存的孢子，不同颜色差异菌株的产孢情况如图7所示，A组为对照组，经产孢培养后孢子大量产生；B组为黄色突变株，产孢能力与对照组无明显差别；C组为白色突变株，经产孢培养后产孢能力明显下降，几乎不产孢。

2.7 三孢布拉氏霉菌色素全波长扫描

为确定三孢布拉氏霉菌菌丝中色素的吸收波长，将菌丝研磨破碎，提取色素全波长扫描，其全波长扫描结果如图8所示，色素在456 nm处具有最大吸光度，因此，此波长下的吸光强度可以用于表征色素的特征吸收光谱，依据文献［13-15］所述，于450 nm左右产生的吸光度主要由β-胡萝卜素产生，可以用来表征该色素的浓度。

2.8 制备β-胡萝卜素标准曲线

为通过吸光强度测定β-胡萝卜素的产量，通过不同浓度色素的吸光度制备标准曲线，根据试验操作选取的β-胡萝卜素浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L，β-胡萝卜素浓度（x）与吸光度（y）呈线性关系，其方程为y＝0.072 5x-0.018 5，r2＝0.997 9。通过标准曲线，结合本试验方法，其色素含量计算公式如下：

色素含量＝［（D+0.018 5）÷0.072 5］×10÷1 000÷0.1。

其中：D为吸光度。

2.9 不同突变株色素产量

由于三孢布拉氏霉菌的菌丝色素成分是复杂的，在450 nm左右的吸光度主要由β-胡萝卜素产生，所以可以通过β-胡萝卜素的标准曲线测定菌丝中色素含量。根据上述试验步骤，其突变株在平板中存在颜色差异，挑选不同突变株对其菌体色素含量测定，根据β-胡萝卜素标准曲线测定色素含量，其结果如表1所示，菌株1和菌株5的颜色与对照组相比为黄色，菌株10与对照组相比为白色。菌株1和菌株5为β-胡萝卜素高产菌株，在未进行任何培养条件优化的前提下，β-胡萝卜产量分别提高48.6%、40.4%；菌株10为负突变菌株，β-胡萝卜产量下降16.5%。

3 讨论

ARTP诱变系统处理三孢布拉氏霉菌孢子其致死率随处理时间的延长逐渐增加，这与王强所做的不同ARTP处理时间下三孢布拉氏霉菌存活率的结果［7］基本一致，在处理160～200 s时，致死率在90%以上，正负突变株在平板上颜色明显。洛伐他汀平板上生长的对照组显浅黄色，诱变处理的突变株在平板上表现出颜色差异，ARTP诱变后的洛伐他汀选择压力能够使菌落产生较为明显的颜色差异，与未诱变的对照组相比，将颜色差异菌株分为4等，分别为深黄色、黄色色、浅黄色和白色，且正突变效率高于负突变效率，可能的原因是洛伐他汀有助于筛选HMG-CoA还原酶过表达菌株，从而增强其代谢途径，促进正突变。纯化后菌株颜色差异明显，纯化后的菌株在传代过程中部分菌株表型性状改变，主要表现在负突变菌株颜色加深回归至野生型状态，部分菌株传代后表型性状稳定性较强，与原性状保持一致，其颜色表型与色素产量吻合。三孢布拉氏霉菌的菌丝中色素经乙酸乙酯萃取后，其最高吸收峰位于456 nm处，这和顾秋亚［13］、王洪波［14］、刘星等［15］测定的菌丝中β-胡萝卜素含量的波长基本一致，均在450 nm附近，此波长下吸光度主要由β-胡萝卜素产生，但由于菌丝中色素成分复杂，β-胡萝卜素含量是高估的。在产孢培养过程中，正突变菌株产孢明显，负突变菌株基本不产孢，可能是负突变菌株抗逆性增强，其产孢差异原因还需深入研究。

表1 不同突变株色素产量及颜色表型

4 结论

建立了三孢布拉氏霉菌ARTP诱变颜色差异菌株筛选手段，在洛伐他汀胁迫下获得了颜色差异明显、遗传性状稳定的突变株共10株，其中深黄4株、黄色3株、浅黄2株、白色1株，正突变株产量上升48.6%，负突变株产量下降16.5%。