巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02的毒理性与固氮能力

林标声，陈 意，罗茂春，张浣星，林占熺

［1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012；2.福建农林大学生命科学学院，福建福州 350002；3.国家菌草工程技术研究中心，福建福州 350002；4.奥兰多（杭州）实业有限公司，浙江杭州310051］

Klebsiella variicola GN02是从巨菌草（Pennisetum sinense Roxb）成熟期根部分离得到的一株具有较高固氮酶活性［378.22 nmol/（mL·h），以C2H4还原量计］的内生固氮菌，前期试验表明其具有良好的溶磷，产氨、产铁载体，分泌抗生素等促生性能，是制备微生物复合菌肥的潜在良好菌株来源［1］。K.variicola GN02属于肠杆菌科克雷伯氏菌属菌株，而克雷伯氏菌属的多类菌株是重要的条件致病菌和医源性感染菌，因而人们对K.variicol在农业上的应用一直存在一定的疑虑［2］。多年来，农业微生物和工业污染治理等方面的研究表明，克雷伯氏菌对植物本身不表现致病性，而且还是一种有效的绿色菌肥和高效净化剂［3］；但也有人认为与植物联合固氮的K.variicola菌株和人源Klebsiella spp菌株之间的遗传差异较小，都有K.pneumoniae的致病相关因子，因此将其制备成微生物菌肥在田间施用具有一定的风险［4］。因此，有必要对K.variicola GN02进行非致病性安全性鉴定，明确其是否安全、无毒。

植物内生固氮菌与植物在长期进化和系统发育过程中建立了一种联合的关系［5］，大量研究表明，禾本科植物接种内生联合固氮菌后能行固氮作用，但由于固氮菌株、植物类型、生长环境等条件的不同，其固氮量存在较大的差异（4.5%～21.2%）［6］。15N同位素稀释法能准确区分和测定植物不同生长时期、不同来源的氮源，成为了植物内生固氮菌固氮量测定的、较为准确和常用的方法［7］，目前在许多豆科植物和禾本科植物中都有应用［8-9］，但尚未发现其在巨菌草中固氮菌的研究中应用。

因此，本研究以GB 15670—1995《农药登记毒理学试验方法》为依据［10］，对K.variicola GN02进行系统的毒理性试验研究，并以K.pneumoniae不同血清型特异性靶基因序列设计相应引物，对K.variicola GN02进行血清型分型，进一步明确其和临床上传染性K.pneumoniae之间的联系。此外，本研究还采用了15N同位素稀释法评价GN02菌株在巨菌草不同生长时期根茎叶中的固氮效率，以期为生产上以GN02菌株制备微生物固氮菌肥，并在巨菌草及其他禾本科植物中的实际应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基及供试动物

K.variicola GN02：由笔者所在实验室从巨菌草成熟期根部分离，并经16SRNA和促生性能鉴定后在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏（CGMCC 1.13619）；肺炎克雷伯氏菌（K.pneumonia）购自杭州滨和微生物试剂有限公司，菌种保藏号CMCC46117；Ashby无氮培养基：甘露醇10 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.1 g/L，CaCO35.0 g/L，pH值7.0～7.2；昆明小鼠，体质量18～20 g；Wistar成年大鼠，体质量200～300 g，均购自福建省闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司；供试菌液为1.5×108CFU/g GN02菌株培养液（或对数生长期培养16～20 h）。

1.2 主要试剂和仪器

15NH4Cl，丰度30.15%，上海化工研究院合成；DNA marker，各限制性内切酶购自天根生化科技（北京）有限公司。

石蜡切片机，莱卡RM2016，徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；研究型正置显微镜，尼康DS-Fi2，尼康仪器（上海）有限公司；PCR仪，ABI-2720，美国Applied Biosystems公司；电泳仪，Mini Pro 300V Power Supply，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 K.variicola GN02急性毒性试验

1.3.1 小鼠急性经口毒性试验 按最大限量法选择健康昆明小鼠40只，雌雄各半，平均分成对照组和试验组。试验组将准备好的GN02菌株供试菌液按0.1 mL/10 g经口灌胃给予小鼠（对照组用同等浓度生理盐水灌胃），灌胃前动物隔夜禁食、自由饮水。灌胃后给予正常饮食，观察14 d，记录小鼠中毒体征及死亡情况，按GB 15670—1995《农药登记毒理学试验方法标准》中所列参考依据评定GN02菌株毒性。同时，将两组小鼠随机抽取3只分别进行呼吸道解剖和肺部的石蜡切片观察，进一步确定2组小鼠接种GN02菌株的病理变化情况。

1.3.2 大鼠急性经皮毒性试验 按最大限量法，选择Wistar成年大鼠20只，雌雄各半，平均分成对照组和试验组。先将2组大鼠分别北部剃毛，面积20 cm2（4 cm×5 cm）。试验组在略小于剃毛面积内用灭菌棉签涂抹GN02菌液（0.1 mL/10 g BW 用量），对照组用同等浓度生理盐水敷药，后用保鲜膜覆盖剃毛区域，并用胶布固定，防止大鼠舔食菌液，涂药时间持续4 h，其间观察并记录2组大鼠是否有中毒现象。涂药结束后，用温水彻底清洗大鼠涂抹皮肤上的菌液，再继续观察14 d，再次观察和记录2组大鼠的中毒体征及死亡情况。按上述的国家标准判断GN02菌株毒性，同样对2组大鼠进行呼吸道解剖和肺部石蜡切片观察，进一步确定2组大鼠接种GN02菌株的病理变化情况。

1.4 GN02菌株血清型检测

GN02菌株DNA的提取采用细菌基因组提取试剂盒［天根生物化科技（北京）有限公司］，采用PCR扩增相关基因，以固氮菌特异性基因NifH和肺炎克雷伯氏菌临床上最为流行的7种分型（K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57）设计特异性引物进行鉴定。7种分型的引物序列参考相关文献，由上海铂尚生物技术有限公司合成；NifH 特异性引物为：引物F，5′-AATGACCATGCGTCAATGC-3′；引物R，5′-GTGAGGATC CTGTGCTCAG-3′。将提取DNA统一浓度为100 ng/μL作为PCR反应体系模板，以无菌去离子水作为阴性对照；同时提取临床上常见的K.pneumoniae CMCC46117基因组DNA，同样以7种分型特异性引物进行鉴定作为对比。PCR反应体系（25μL）：DNA模板0.5μL，H2O 7.5μL，引物F（10μmol/L）1μL，引物R（10μmol/L）1μL，2×Taq PCR Master Mix 10μL；PCR反应条件：94℃4 min；94℃45 s，58℃45 s，72℃90 s，30个循环；72℃2 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.5 K.variicola GN02对巨菌草生物固氮的影响

1.5.1 采用15N同位素稀释法 将温室中培养好的巨菌草小苗（5～10 cm）从秧苗培育盘中取出，将根部清洗干净，在超净台上将苗用2%次氯酸钠表面消毒5～10 min，再用无菌水清洗，用灭菌小刀轻划根系，再浸入对数生长期的GN02菌株培育菌液中30 min，同时以无菌水蒸馏水浸泡为对照。

将试验用土过筛、高压灭菌后分装于16.5 cm×11 cm的塑料盆（购自鑫腾花卉专营店，江苏宿迁），每盆施入1.5 g15NH4Cl，对照组和试验组各栽11盆，共22盆，每盆栽巨菌草苗各3～5株。用无菌水配制无氮培养基营养液，每隔5 d浇无菌水600～800 mL/桶，每隔10 d浇此营养液600～800 mL/桶，直至试验结束。

1.5.2 固氮量和固氮率的测定 分别在巨菌草生长的苗期、分蘖期、拔节期和成熟期4个时期，将塑料桶剪开，除去植株根部泥土、洗净，每时期取样3桶，包括根、茎和叶，剪碎、混匀，60～70℃烘干，各样品分别取1 g送至上海化工研究院测定全氮含量和15N原子百分超。按下列公式计算植株的固氮量和固氮率，并对所得数据进行统计学差异分析（SPSS 17.0软件）。

2 结果与分析

2.1 GN02菌株急性毒性试验

小鼠急性经口毒性试验和大鼠急性经皮毒性试验表明，小鼠灌胃和大鼠经皮涂菌后，动物均未发现明显的中毒现象，连续观察14 d，也均未发现动物死亡现象（表1），试验结束后，动物解剖也未发现异常，动物呼吸道（特别是肺部）没有发现明显的病变（图1）；与对照组相比，试验组的肺部石蜡切片不同部位的对比观察也未发现明显的异常（图2）。按GB 15670—1995《农药登记毒理学试验方法标准》中所列参考依据评定GN02菌株毒性为微毒以下，无明显毒性，可在农业生产上应用。

表1 GN02菌株急性毒性试验结果

2.2 GN02菌株血清分型的结果

以肺炎克雷伯氏菌临床上最为流行的7种分型引物对GN02菌株进行鉴定，结果如图3所示，以GN02-DNA为模板，NifH引物扩增为阳性；分别以H2O、GN02-DNA为模板，7种分型引物扩增均为阴性；以K.pneumoniae CMCC46117-DNA为模板，7种分型引物扩增鉴定为K2分型。该研究结果表明，GN02菌株具有固氮菌特异性基因NifH，但不属于7种临床上流行的肺炎克雷伯氏菌分型，不是流行的肺炎克雷伯氏菌强毒力菌株，不会引起严重的临床疾病。

2.3 GN02菌株对巨菌草生物固氮的影响结果

将GN02菌株接种于巨菌草，其不同生长时期根茎叶的固氮率和固氮量见表2。结果表明，GN02菌株在不同生长时期巨菌草根茎叶中均具有一定的固氮能力；根、茎、叶固氮率和固氮量均为成熟期＞拔节期＞分蘖期＞苗期，各成熟期固氮率可达15%～27.27%，与其他禾本科植物所报道的固氮菌固氮效率基本相当［11-12］，且各成熟期固氮率和固氮量与其他时期相比均达到了显著差异（P＜0.05），表明随着种植时间的延长，GN02固氮菌株数量逐渐增加，固氮效率也逐渐提高；而在同一生长时期，不同部位的固氮率和固氮量均表现为叶＞根＞茎，且各生长时期叶的固氮率和固氮量与根、茎相比差异叶均达到了显著水平（P＜0.05）。

3 小结

近年来，许多学者都报道了K.variicola能够在甘蔗［13］、石斛［3］、香蕉［4］等植物内部定殖，并具有良好的固氮促生性能，但同时人们对K.variicola对动物和植物的潜在致病性一直存在担忧，对其在农业上的应用持谨慎态度。

本试验研究了一株从巨菌草中分离的内生固氮菌Klebsiella variicola GN02的毒理性固氮能力，结果表明，GN02菌株无明显的经口毒性和经皮毒性，不是临床上流行肺炎克雷伯氏菌已有分型的强毒力菌株；GN02菌株在不同生长时期巨菌草根茎叶中均具有一定的固氮能力，不同生长时期其固氮率和固氮量均为成熟期＞拔节期＞分蘖期＞苗期，在同一生长时期其固氮率和固氮量均为叶＞根＞茎；根茎叶各成熟期固氮百分率可达15%～27.27%，与其他禾本科植物所报道的固氮菌固氮效率基本相当。表明GN02菌株安全、无毒，具有一定的固氮能力，可在农业生产中使用，并为将来以其为菌株资源制备固氮菌肥、挖掘应用潜能、在绿色农业可持续发展中发挥重要作用奠定理论基础［14］。

表2 不同生长时期巨菌草根、茎、叶的固氮率和固氮量