基于激光扫描共聚焦显微技术的烤烟叶面组织粗糙度参比样研究和应用

徐昭梅，谢新乔，邓邵文

［红塔烟草（集团）有限责任公司，云南玉溪653100］

激光扫描共聚焦显微技术由显微镜光学系统、激光光源、电子摄像和计算机图像处理系统4个部分组成，其主要的技术优势是分辨率高、成像速度快、自动化程度高，能获得连续的光学切片，对较厚（＞10μm）样品的快速三维重建，可全方位认识样品组织结构的形貌形态［1］。激光扫描共聚焦显微技术在冶金、化工、生物、医学领域应用十分广泛，能观测样品表面的三维微观形貌特征，并对微观的形貌参数（如深度、高度、长宽、体积、面积、粗糙度等）进行定量分析，因而激光扫描共聚焦显微技术可以为烟叶外观特征的量化研究提供有效手段。

烟叶组织粗糙度与烟叶叶龄、着生部位、品种特性、栽培管理、调制技术、土壤环境和气候条件等密切相关［2］。王信民等将叶面组织作为外观区域特征的评价指标之一，叶面组织指烟叶表面状态及木质化程度给予视觉、触觉的粒面精细程度和质感，可分为粗糙、较粗糙、较细腻和细腻4个档次［3］。王亚平等认为，叶片结构与粗糙度密切相关，将叶片结构分解为粗糙度、充实度、弹性、柔软度等4个因子描述词，对粗糙度的释义为通过视觉或触觉感受到叶片表面细腻、凹凸不平的程度，正常成熟的烟叶，部位越高，细胞结构越紧密，表皮的叶面组织越粗糙［4］。在感官分析技术中，叶面组织的粗糙细腻程度属于表面几何质地特性的范畴［5］；粗糙度是作为质地特性的因子之一［6］，而现行标准［7］中对叶面组织粗糙度的规范相对模糊。在机械、纺织领域，粗糙度的表征已取得实质性进展，而在烟叶评级领域［8-9］，对叶面组织粗糙度的量化及量值确定至今仍未见报道［3，10］。因此，本研究针对烟叶表皮的叶面组织参比样进行系统研究，合理划分梯度并描述，使用激光扫描共聚焦显微镜定量表征叶面微观形貌，运用心理物理学定律［11］验证，为烟叶评级从传统技艺走向科学、成为学科提供参考依据，实现传统评级可传承和现代评级可量化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

选用云南玉溪地区的K326全叶位的初烤烟样品作为参比样品的供试材料；选用云南玉溪世界烟草品种园种植的红花大金元、K326、KRK26、NC71、云烟97、中烟100、云烟87和福建三明种植的翠碧1号，收集第9至第10有效叶位的初烤烟样品作为品种识别的供试材料。

所用仪器为Olympus OLS4100激光扫描共聚焦显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 评价小组的成立 依据GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分：优选评价员》［12］，邀请13位获得中国标准化研究院感官分析优选评价员资格的评价员组成评价小组。

1.2.2 评价样品的准备 采集样品后，将1/3的叶尖部、1/3的叶基部和叶缘去除，制作成8 cm×6 cm的长方形叶片。依据YC/T 291—2009《烟叶分级实验室环境条件》［13］，进行48 h以上的温湿平衡，使烟叶水分达到并保持在16%～18%。

1.2.3 粗糙度评价 评价小组通过感官分析技术对参比样进行多次测试，确定参比样实物、档次、特征描述；使用15 cm线性标度对样品粗糙度进行感觉强度的量化，作为样品粗糙度的感官标度值；选取叶片中间离主脉约2 cm的位置，避开支脉、残伤、油印或病斑部分打孔取样，采用Olympus OLS4100激光扫描共聚焦显微镜，放大倍数为20×50，扫描范围为257μm×257μm，对样品叶面进行3D形貌观察及粗糙度参数测量。

利用感官强度值与仪器测量值作斯蒂文心理物理功效回归分析，即ln S＝ln K+n ln I。其中：S为感觉响应强度（即感官标度值）；K为常数；I为物理刺激强度（即仪器测量值）。验证粗糙细腻度的感官标度值与仪器测量值之间的相关性。采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 参比样的测试

表1为13位评价员对叶面组织粗糙度参比样品进行Friedman检验［14］的测试结果，评价小组经多次测试，将所有样品的粗糙度划分成7个档次。3j（p+1）＝74.26（Ftest为联合假设检验，j、p为自由度，R为常数），查文献［15］中的表可知α＝0.05、j＝13、p＝7时对应的临界值为12.37，Ftest＝74.26＞12.37，因此可以判断7个样品在整体上是存在显著差异的，参比样实物如图1所示。

表1 叶面组织粗糙度参比样感官测试结果

2.2 确定参比样

2.2.1 感官评价 叶面组织粗糙度的7个档次的描述词可用细腻、较细腻、稍细腻、中等、稍粗糙、较粗糙和粗糙进行表征；并对每个档次进行描述性分析；使用15 cm线性标度［16］对样品进行感觉强度的量化，如表2所示。

2.2.2 形貌观察 由图2可知，烟叶表面主要为嵴状隆起，其中7档粗糙，6档较粗糙，6、7档表面均有尖锐的针状隆起，5档稍粗糙，4档中等，且4、5档表面有粒状隆起，3档稍细腻，2档较细腻，1档细腻，且1、2、3档表面波状脊隆起较为平缓。1档细腻，隆起最大高值为18.31μm；2档较细腻，隆起最高值为29.18μm；3档稍细腻，隆起最高值为39.12μm；4档中等，隆起最高值为57.45μm；5档稍粗糙，隆起最高值为81.65μm；6档较粗糙，隆起最高值为120.77μm；7档粗糙，隆起最高值为213.48μm。

由表3可知，7种不同档次粗糙度的烟叶表面形貌特征参数Sa差异明显，随着粗糙度的增强，表面形貌平均高度Sa有上升的趋势，Sa大小排序如下：7档（粗糙）＞6档（较粗糙）＞5档（稍粗糙）＞4档（中等）＞3档（稍细腻）＞2档（较细腻）＞1档（细腻），与样品粗糙度感官评价结果的顺序一致。表面形貌高度的尖峭度Sku在各粗糙度档次之间无显著差异，3档（稍细腻）、6档（较粗糙）和7档（粗糙）的Sku＜3，表示表面形貌脊状隆起多为较钝化的类型；1档（细腻）、2档（较细腻）和5档（稍粗糙）的Sku值接近3，表示表面形貌脊状隆起较尖锐的类型和较钝化的类型几乎一样多；4档（中等）的Sku＞3，表示表面形貌脊状隆起多为较尖锐的类型。

表2 叶面组织粗糙度感官评价

表3 叶面组织粗糙度主要物理参数分析

综上所述，在4档（中等）、5档（稍粗糙）、6档（较粗糙）和7档（粗糙）的样品里，随着粗糙度的增加，隆起最大高度也有变大的趋势，说明叶面的隆起最大高度和平均高度Sa对粗糙度贡献率较大，蜡质层和角质层也起一定的影响作用；在1档（细腻）、2档（较细腻）和3档（稍细腻）的样品里，由于叶表面无明显颗粒物，隆起最高值的变化梯度不大，说明叶面的隆起最大高度对粗糙度影响不大，主要是表面形貌平均高度Sa对粗糙度的影响较大。

2.2.3 量值确定

2.2.3.1 相关分析 将仪器测量的粗糙度相关参数与感官标度值做相关分析（表4），筛选特征物理量。

表4 叶面组织粗糙度感官强度与物理参数的相关分析

由表4可知，感官强度与表面形貌平均高度Sa呈极显著正相关且相关系数达到0.98，感官强度与尖峭度Sku的相关性未达显著水平。因此将表面形貌平均高度Sa作为叶面组织粗糙度的典型特征指标。

2.2.3.2 斯蒂文心理物理功效函数验证 心理物理学研究表明，感觉响应强度与物理刺激强度的自然对数值呈线性关系：S＝KIn。将该式转换为自然对数式，即ln S＝ln K+n ln I，也称为斯蒂文心理物理功效函数。

以仪器测量值的自然对数（ln Sa）为自变量X、粗糙度感官标度值的自然对数（ln M）为因变量Y，建立的回归模型如下：

说明样品的粗糙度感觉量（M）的变化与仪器测量的物理量（Sa）之间符合心理物理学幂定律，在一定程度上说明样品的选择和特征参数的甄选是合理的，最终据此建立初烤烟叶面粗糙度参比样（表5）。

表5 叶面组织粗糙度参比样体系

2.3 粗糙度在品种识别中的应用

如图3所示，翠碧1号叶表面隆起有直径41.26μm、高16.83 μm 的中空圆柱体结构，叶面隆起最大高度为24.66μm；红花大金元叶面隆起最大高度为28.23μm；KRK26叶面隆起最大高度为32.28μm；NC71叶面隆起最大高度为30.87μm；K326叶面隆起最大高度为25.86μm；云烟87叶面隆起最大高度为26.56μm；云烟97叶面隆起最大高度为40.51μm；中烟100叶面隆起最大高度为45.47μm。

由表6可知，表面形貌高度的尖峭度Sku在各品种的中部初烤烟之间无显著差异。8种不同品种的中部初烤烟表面形貌粗糙度参数Sa差异明显，结合图3的微观形貌分析，可将8个品种分为5个类型，其中翠碧1号为第1类，属于细腻档次，且叶表面有独特的中空圆柱体结构；红花大金元和云烟87为第2类，属于细腻至较细腻档次；NC71、K326和KRK26为第3类，属于较细腻至稍细腻档次；云烟97为第4类，属于中等档次，中烟100为第5类，属于中等至稍粗糙档次。Sa大小为中烟100＞云烟97＞KRK26＞K326＞NC71＞云 烟87＞红花大金元＞翠碧1号。

3 结论

采用激光扫描共聚焦显微镜对叶面组织的微观形貌进行观察，发现烟叶表面存在大量的嵴状隆起区域，可将烟叶分为细腻、较细腻、稍细腻、中等、稍粗糙、较粗糙和粗糙7个档次，其粗糙度参数Sa分别为2.95、3.60、4.54、5.56、6.67、8.26、10.34μm。基于心理物理学定律建立起了烤烟叶面组织粗糙度参比样体系，为烟叶评级提供了一把可参考的标尺。不同品种初烤烟的粗糙度也有一定差异，中烟100叶面组织粗糙度最大，翠碧1号叶面组织粗糙度最小且叶表面隆起有直径41.26μm、高16.83μm的中空圆柱体结构。

表6 不同烤烟品种叶面组织粗糙度的主要物理参数