核桃青皮提取液在腹泻小鼠体内的抑菌效果

韩晓云，刘 鹏，王 震，范学红

（商洛职业技术学院，陕西商洛 726000）

抗生素的应用解决了很多医学难题，但是正是由于抗生素较好的抑菌效果，使得抗生素被广泛滥用，从而引发了一系列问题，如耐药菌的产生。耐药菌的产生给人类公共卫生及健康造成了巨大的威胁。当前我国抗生素滥用问题尤为严重，每年抗生素总用量约占世界的一半，这使得我国病菌耐药现象也异常广泛。其中大肠杆菌的耐药问题不容忽视，其耐药率在临床中呈上升趋势［1］，且多重耐药检出率也较高，给临床治疗带来很大困难［2］。

研究表明，核桃青皮提取物在体外具有较好的抑菌效果［3-5］，但关于其体内抑菌效果试验研究甚少。为减少抗生素的使用及减缓耐药菌株的产生，本试验首次研究核桃青皮乙醇提取物对致病性大肠杆菌O157∶H7腹泻模型小鼠的体内抑菌效果，为开发新型抗感染药物提供依据。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌O157∶H7购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌选择性培养基（麦康凯琼脂）、乳酸菌选择性培养基（MRS琼脂）、肠杆菌选择性培养基（VRBDA）及双歧杆菌选择性培养基（TPY）均购自青岛海博生物技术有限公司。KM小鼠购自陕西省医学实验动物中心，保持饲养环境温度25℃左右，标准小鼠饲料喂养，自由饮水。

PYX-DHS-50X65-BS隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；ZHCH-C1106B超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；YKH-I型液体快速混合器（江西医疗器械厂）；YX280型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司）；JA2003电子天平（上海衡际科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 动物试验设计 随机选取无特定病原体（SPF级）昆明（KM）小鼠60只随机分为3组，即Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组，每组20只。Ⅱ组、Ⅲ组连续7 d中午灌胃大肠杆菌菌液，灌胃体积为10 mL/kg（菌悬液/小鼠体质量）［6］；空白对照组灌胃等体积生理盐水。灌胃7 d后，第8天开始治疗，Ⅲ组每天灌胃核桃青皮乙醇提取物，Ⅱ组用生理盐水作对照，持续时间为7 d。试验设计方案见表1。

表1 小鼠灌胃试验设计

1.2.2 灌胃液制备

1.2.2.1 大肠杆菌灌胃液的制备 先将大肠杆菌O157∶H7标准菌株进行增菌培养，并绘制菌株的生长曲线图确定其群体生长的稳定期，取稳定期（16 h）的大肠杆菌菌液5 000mL，在4℃条件下，离心10min后收集菌体，无菌生理盐水清洗3次后称质量，向菌体中加入一定体积的无菌生理盐水，调整菌浓度为108CFU/mL，4℃储存待用。

1.2.2.2 核桃青皮乙醇提取物治疗液的制备 手工剥下新鲜核桃青皮［7］，采用冷冻干燥法进行处理［8］。冷冻条件：压力为10 Pa，温度为-45℃，含水率为3.28%。待样品充分干燥后，进行粉碎并过0.425 mm筛网。称取冷冻干燥的样品粉末10.00 g，加入200 mL 95%乙醇溶液，65℃下回流提取2 h，将提取物进行过滤后再浓缩，再将浓缩液用水定容至1 000 mL，相当于生药含量为10 mg/mL，作为试验母液。取母液10 mL，用蒸馏水稀释至生药含量为1 mg/mL，用于抑菌试验。

1.2.3 灌胃后小鼠的表象观测 在对小鼠进行试验过程中，每天观察记录3组小鼠的身体状况（包括小鼠精神状态、进食状况、外观毛发、粪便形态），用以评价小鼠的表象特征。

1.2.4 小鼠肠道菌群的检测

1.2.4.1 粪便采集 每天09：00用逼迫法采粪便，轻轻挤尾巴根部直肠末端，待排粪便后收集于无菌管中；粪便混悬液制备：将采集到的粪便进行称量，再加入相应体积的无菌生理盐水，在混悬仪上充分混合，制成粪便混悬液；粪便混悬液稀释：将混悬液进行10倍梯度稀释，每个稀释做3个平行。

1.2.4.2 检测指标及方法 大肠杆菌计数。采用涂布平板法，将10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度粪便稀释液1 mL均匀涂布于麦康凯琼脂37℃培养10 h，对平板中的显金属光泽的紫色菌落进行计数［9］，计算出1 g粪便中的菌含量（CFU/g），结果以活菌数常用对数值表示［10］。

肠杆菌计数。采用涂布平板法，将10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度粪便稀释液1 mL均匀涂布于营养琼脂37℃培养10 h，对显红色且有胆盐沉淀环的菌落计数，计算出1 g粪便中的菌含量（CFU/g），结果以活菌数常用对数值表示。

乳酸菌计数。采用涂布平板法，将10-6、10-7、10-8、10-9、10-10梯度粪便稀释液1 mL均匀涂布于MRS琼脂厌氧环境下37℃培养10 h，对平板菌落进行计数，计算出1 g粪便中的菌含量（CFU/g），结果以活菌数常用对数值表示。

双歧杆菌计数。采用涂布平板法，将10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度粪便稀释液1mL均匀涂布于TPY琼脂厌氧环境下37℃培养10 h，对平板菌落进行计数，计算出1 g粪便中的菌含量（CFU/g），结果以活菌数常用对数值表示。

2 结果与分析

2.1 核桃青皮乙醇提取物对感染大肠杆菌O157∶H7小鼠表象的影响

在灌胃期间，每天观察试验小鼠的表象特征。试验前3 d各组小鼠变化不大，但是在试验第4天，Ⅱ组和Ⅲ组小鼠出现精神状态不佳及少量腹泻现象，且其毛发光泽度较Ⅰ组小鼠明显暗淡，进食量也显著减少，此类表象说明小鼠已经发生病变，造模成功。在试验第8天开始，Ⅲ组小鼠在灌胃核桃青皮乙醇提取物后，病症较Ⅱ组有所减轻，进食量也有所增加。这说明核桃青皮乙醇提取物对治疗感染大肠杆菌O157∶H7的小鼠有一定的抑菌疗效。

2.2 核桃青皮乙醇提取物对感染大肠杆菌O157∶H7小鼠肠道微生物数量的影响

2.2.1 核桃青皮乙醇提取物对感染大肠杆菌O157∶H7小鼠肠道大肠杆菌数量的影响 从图1中可以看出，Ⅰ组小鼠体内大肠杆菌数量在试验期间波动不大，而Ⅱ组与Ⅲ组出现了明显的变化。在灌胃第3天后，Ⅱ组与Ⅲ组的小鼠肠道内的大肠杆菌数量开始增多，并在灌胃7 d后，出现了升高约3个数量级的差异。这可能是由于大肠杆菌作为生物肠道内的条件致病菌，虽在机体正常情况下，对人体无害，但是当机体菌群失调后，它们会随即转为有害菌开始对机体造成威胁，使机体出现肠胃生理功能紊乱的症状。另在开始进行核桃青皮乙醇提取物灌胃治疗后，Ⅲ组小鼠肠道内大肠杆菌数量开始减少，并在治疗后第4天数量大幅下降，达到了Ⅰ组的正常水平，与Ⅱ组小鼠肠内状况有显著差异（P＜0.05）。此结果说明核桃青皮乙醇提取物对肠道内致病性大肠杆菌有一定的抑制或杀灭作用。

2.2.2 核桃青皮乙醇提取物对感染大肠杆菌O157∶H7小鼠肠杆菌数量的影响 从图2中可以看出，Ⅰ组小鼠体内肠杆菌数量相对较低，且在试验期间一直维持在同一水平，而Ⅱ组与Ⅲ组均出现了明显的变化。在灌胃后第2天Ⅱ组与Ⅲ组的小鼠肠道内的肠杆菌数量开始增多，之后每天肠杆菌检出数量都在增多，并在灌胃7 d后达到最高，升高了约4个数量级。这主要是由于肠杆菌中如变形杆菌等大多属于条件致病菌，当机体由于进入大量致病菌大肠杆菌O157∶H7时，小鼠肠道内条件致病菌由正常菌群变成致病菌，一方面通过营养竞争，另一方面通过释放胺等物质发挥生物拮抗作用，最终使得益生菌数量大大减少。在开始药物治疗后，Ⅲ组小鼠肠道内肠杆菌数量于试验第9天开始下降，并在药物灌胃第15天达到Ⅰ组的正常水平，与未进行治疗的Ⅱ组小鼠肠道状况形成了显著差异（P＜0.05）。此结果说明核桃青皮乙醇提取物对肠道内肠杆菌有一定的抑制或杀灭作用。

2.2.3 核桃青皮乙醇提取物对感染大肠杆菌O157∶H7小鼠肠道乳酸菌的影响 从图3中可以看出，Ⅰ组小鼠体内乳酸菌数量相对较高，且在试验期间波动不大，而Ⅱ组与Ⅲ组同样出现了明显的变化。在灌胃后第2天Ⅱ组与Ⅲ组的小鼠肠道内的乳酸菌数量开始减少，之后每天检出数量都在减少，并在灌胃7 d后乳酸菌减少了2个数量级。这也主要是由于致病性大肠杆菌的增多导致了肠道内环境的微生态平衡遭到破坏，使得乳酸菌等益生菌的生长繁殖因为营养竞争等关系受到抑制。图3显示，在进行核桃青皮乙醇提取物进行灌胃后Ⅱ组与Ⅲ组的小鼠肠道内乳酸菌的数量也没有恢复如初，与Ⅰ组的小鼠肠道乳酸菌状况有显著差异（P＜0.05）。这可能是由于核桃青皮乙醇提取物对肠道菌群有广谱抑菌效果，在抑制致病菌、条件致病菌的过程中，对肠道益生菌也起了抑制作用。

2.2.4 核桃青皮乙醇提取物对感染大肠杆菌O157∶H7小鼠肠道双歧杆菌的影响 由图4可知，Ⅰ组小鼠肠道内双歧杆菌数量相对稳定，与Ⅰ相比，Ⅱ与Ⅲ组在对小鼠进行大肠杆菌O157∶H7灌胃期间，小鼠肠道内双歧杆菌数量在逐渐下降，且灌胃时间越长，数量减少得越多，这主要是由于大肠杆菌灌胃后，短时间大肠杆菌数量急剧增多，破坏了小鼠肠道内的微环境，取代了肠道内最初优势菌，成为最新优势菌，并通过营养竞争抑制了双歧杆菌的生长繁殖。进行核桃青皮乙醇提取物药物治疗后，双歧杆菌数量也未能明显增加，这可能是由于核桃青皮乙醇提取物具有广谱抑菌作用，对双歧杆菌的生长繁殖也发挥了抑制作用导致的结果。

3 结论与讨论

吕海宁等研究发现核桃青皮对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有显著的抑菌活性［11］，张卫星等研究表明核桃青皮提取物具有抗菌和抗氧化活性［12-13］，丁存宝等研究发现，核桃青皮烘干粉末95%乙醇萃取液对白色葡萄球菌、伤寒杆菌具有一定的抑菌作用［14］。唐春丽等研究发现核桃青皮提取物具有很强的抗菌和抗真菌效果［15-16］。本试验首先对小鼠进行大肠杆菌O157∶H7灌胃造模，在造模第4天试验小鼠出现病症，说明造模成功。随后用核桃青皮乙醇提取物进行灌胃治疗，小鼠病症减轻。试验期间对小鼠肠道内大肠杆菌、肠杆菌等条件致病菌的数量进行计数，结果表明在进行大肠杆菌O157∶H7灌胃期间，条件致病菌数量呈上升趋势，且上升明显，但在进行核桃青皮乙醇提取液灌胃治疗后，条件致病菌数量开始下降，且在灌胃7 d后回到初始水平，与Ⅰ组小鼠无差异。小鼠临床病症及体内条件致病菌数量的检测结果都说明该提取物对治疗大肠杆菌O157∶H7感染引起的腹泻有一定的疗效，这与前人的体外试验有抑菌作用的结果相一致。但是核桃青皮提取物治疗腹泻的机制是否是由单一的抑菌效果所导致的，又或者通过刺激肠道黏膜增强黏膜相关免疫的屏障作用来协同抑菌的，还须要做深入研究。

乳酸菌、双歧杆菌等属于生物肠道中益生菌，他们的存在可以增强肠道黏膜免疫屏障作用，调节免疫系统，预防和治疗肠道感染。须要注意的是，试验期间对小鼠肠道内乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的数量进行计数，结果表明在进行大肠杆菌O157∶H7灌胃期间，乳酸菌、双歧杆菌等益生菌数量呈下升趋势，且下降明显，且在进行核桃青皮乙醇提取液灌胃治疗后，益生菌数量下降趋势得到一定的改善，但在灌胃治疗7 d后，益生菌数量亦没有显著提升，与Ⅰ组小鼠体内益生菌熟练形成显著差异，这说明该提取物具有广谱抗菌作用，在抑制大肠杆菌O157∶H7生长繁殖的同时，对肠道内益生菌也发挥了抑制作用。因此核桃青皮乙醇提取液在以后用作新兴医疗抗感染药物时要考虑联合使用益生菌产品，来帮助病人的肠道微生态环境尽快恢复平衡［17］。