制备靶向相变型载硫化铋纳米粒并用于体外CT/超声显像

周 頔，王志刚，文 明，李咏梅，吕发金*

(1.重庆医科大学附属第一医院放射科，重庆 400016； 2.重庆医科大学超声影像学研究所，重庆 400010)

研制集显影和治疗为一体的多功能纳米粒是近年研究热点[1]。理想的纳米粒应具有特异性聚集、安全无毒及循环时间长等优点[2]，但目前纳米粒仍存在非特异性聚集、循环时间短等不足。硫化铋(bismuth sulfide, Bi2S3)对X线有极高吸收力，是较好的CT成像对比剂[3]。全氟已烷(perfluorohexane, PFH)在一定条件下可发生液气相变，增强超声显像效果[4]。本研究拟构建叶酸靶向相变型载Bi2S3纳米粒(folate-targeted phase-transition nanoparticles carrying bismuth sulfide， FBS-PFH-NPs)，观察其基本特性、体外细胞靶向能力及CT/超声(ultrasound， US)双模态显像效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料 二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipa lmitoyl phosphatidyl choline， DPPC； Sigma公司)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000， DSPE(PEG2000)； Sigma公司]，胆固醇(cholesterol， CH； Avanti公司)，叶酸修饰的DSPE(PEG2000)[DSPE(PEG2000)Folate； Sigma公司]，二棕榈酰磷脂酰甘油(distearoyl phosphatidylglycerol, DPPG； Sigma公司)，PFH(Avanti公司)，叶酸(Sigma公司)，Bi2S3纳米颗粒(中国科学院上海硅酸盐研究所)，DMEM培养液(Gibco公司)。

1.1.2 实验仪器 Malvern激光粒径仪，Olympus IX53光学显微镜(简称光镜)，Hitachi H-7600透射电子显微镜，KLUKE st18远红外测温仪，Agilent 7500ce电感耦合等离子体发射光谱仪(inductively coupled plasma optical emission spectrometer， ICP-OES)，SONIC VCX-130超声破碎仪，海扶JC型HIFU治疗系统，百胜Mylab 90彩色超声诊断仪，GE LightSpeed CT扫描仪，DFY图像定量分析仪(重庆医科大学超声影像学研究所自行研发)。

1.2 制备纳米粒 将200 μl Bi2S3(10 mg/ml)与 200 mg DPPC、DSPE(PEG2000)Folate、DPPG及CH(4种试剂的体积比为5.0∶3.0∶1.5∶1.5)溶于20 ml三氯甲烷，于45℃下采用旋转蒸发仪旋蒸2 h(55 r/min)，加入2 ml PBS水化，而后滴加200 μl PFH，冰浴条件下采用超声波破碎仪振动乳化5 min。将振动乳化后的混合溶液转移至离心管，洗涤、3 500 r/min离心3次(每次5 min)，弃上清液和底层未包裹Bi2S3，加入少量PBS混匀，获得FBS-PFH-NPs。按照相同方法采用DSPE(PEG2000)制备非靶向载硫化铋及全氟已烷纳米粒(non-folate-targeted nanoparticles carrying bismuth sulfide and perfluorohexane， NBS-PFH-NPs)，不加入Bi2S3制备叶酸靶向载全氟已烷纳米粒(folate-targeted nanoparticles carrying perfluorohexane， F-PFH-NPs)。另取Bi2S3、DPPC、DSPE(PEG2000)Folate、DPPG及CH按上述方法溶于三氯甲烷，同时加入10 μl荧光染料DiI混合溶解，制备载DiI标记的FBS-PFH-NPs(DiI-FBS-PFH-NPs)，同时制备DiI标记的NBS-PFH-NPs(DiI-NBS-PFH-NPs)。

1.3 FBS-PFH-NPs基本特性检测 采用光镜及透射电镜观察FBS-PFH-NPs形态；激光粒径仪测量粒径；X线衍射检测其衍射图谱；ICP-OES检测纳米粒中Bi2S3含量。

1.4 体外细胞寻靶实验 将宫颈癌Hela细胞置于37℃、5% CO2、恒温培养箱培养，取对数生长期细胞消化后接种于激光共聚焦培养皿中，共9 ml，每个培养皿加入1 ml细胞悬液，每组3皿，培育24 h；随机分为靶向组、非靶向组及抗体封闭组，分别在靶向组、非靶向组培养基中加入100 μl DiI-FBS-PFH-NPs (1 mg/ml)及100 μl DiI-NBS-PFH-NPs(1 mg/ml)，在抗体封闭组培养基中加入1 mmol/L游离叶酸溶液 1.5 ml及100 μl DiI-FBS-PFH-NPs(1 mg/ml)，均孵育 2 h；加入细胞膜荧光染料DiO(1 mg/ml)染色20 min，PBS冲洗；激光共聚焦显微镜下观察各组纳米粒与Hela细胞连接情况。

将对数生长期的Hela细胞(1×105/ml)接种于无菌离心管，各管中分别加入含不同浓度Bi2S3(0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg/ml)的FBS-PFH-NPs(靶向组)和NBS-PFH-NPs(非靶向组)，孵育2 h后PBS冲洗，采用流式细胞仪检测纳米粒与细胞的连接率。

1.5 体外成像

1.5.1 体外CT成像 将生理盐水(saline组)、 F-PFH-NPs(F-PFH-NPs组)及含不同浓度Bi2S3(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/ml)的FBS-PFH-NPs(FBS-PFH-NPs组)分别加入Eppendof管中进行CT扫描(管电流170 mA、管电压100 kV、层厚5 mm)，以GE AW 4.3软件测量管中溶液CT值。

1.5.2 体外声致相变 将5 ml FBS-PFH-NPs(FBS-PFH-NPs组)加入Eppendof管，分别采用60、90、120、150及180 W功率HIFU辐照2 s，以saline为对照(saline组)，采集saline组及FBS-PFH-NPs组相变前后二维及造影模式声像图，使用DFY图像定量分析仪测量回声强度值。辐照完毕，采用远红外测温仪记录溶液温度变化，光镜观察相变前后纳米粒数量及大小等。

1.5.3 体外超声成像 将saline(saline组)、F-PFH-NPs(F-PFH-NPs组)及含不同浓度Bi2S3(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/ml)的FBS-PFH-NPs(FBS-PFH-NPs组)分别装入孔洞琼脂糖凝胶模型，采用超声诊断仪采集各组二维声像图，以DFY测量回声强度。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计分析软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FBS-PFH-NPs基本特性 FBS-PFH-NPs于光镜下呈球形，分散性好；透射电镜下呈壳核结构，Bi2S3分布于脂质壳膜；平均粒径为(458.50±69.22)nm。FBS-PFH-NPs与单纯Bi2S3的衍射图谱峰值相对应；FBS-PFH-NPs中Bi2S3含量为1.0 mg/ml。

2.2 体外细胞寻靶 激光共聚焦显微镜下，靶向组大量FBS-PFH-NPs结合在Hela细胞周围(图1A)，而非靶向组(图1B)和抗体封闭组(图1C)均未见红色纳米粒与Hela细胞结合。相同Bi2S3浓度下，靶向组与Hela细胞的连接率均高于非靶向组(P均<0.01)，随纳米粒中Bi2S3浓度增加，2组纳米粒与Hela细胞连接率均增加(P均<0.01),见表1。

2.3 体外成像

2.3.1 体外CT成像 saline组和F-PFH-NPs组CT图像均呈低密度，FBS-PFH-NPs组呈高密度(图2A)。纳米粒中Bi2S3浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0 mg/ml时，FBS-PFH-NPs组CT值分别为(30.60±4.30)HU、(56.60±2.90)HU、(83.70±10.60)HU、(110.00±8.60)HU及(150.00±9.60)HU，随Bi2S3浓度增高CT值逐渐增高(F=146.14，P<0.01)。

2.3.2 体外声致相变 二维(图2B)及造影模式(图2C)声像图均显示，辐照后saline组回声强度及温度均无明显变化，FBS-PFH-NPs组回声强度及温度逐渐增加(F=110.09、440.69，P均<0.01)，且均高于saline组(P均<0.01)，见表2、3。光镜下观察，HIFU未辐照时FBS-PFH-NPs未见异常；当以60 W HIFU辐照时相变增大的气泡少见，功率为90 W时可见小气泡，120 W时气泡增多、增大，150 W时气泡数量更多、体积更大，且部分融合破裂，180 W时气泡数量最多、体积最大，但多数破裂。

表1 靶向组、非靶向组与Hela细胞连接率比较(%，±s)

表1 靶向组、非靶向组与Hela细胞连接率比较(%，±s)

组别Bi2S3浓度(mg/ml)0.250.501.001.502.002.50F值P值靶向组23.44±2.3333.81±1.2948.14±2.0660.59±4.0075.58±0.8187.44±5.56183.12<0.01非靶向组9.61±3.4618.79±3.4423.27±2.0732.72±1.6840.24±5.6357.27±2.7474.08<0.01t值5.747.0814.7311.1210.768.43——P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01——

表2 saline组与FBS-PFH-NPs组不同功率HIFU辐照下回声强度比较(dB，±s)

表2 saline组与FBS-PFH-NPs组不同功率HIFU辐照下回声强度比较(dB，±s)

组别HIFU功率(W)6090120150180F值P值saline组12.33±2.5211.67±2.0812.33±2.0812.67±2.0813.67±2.52——FBS-PFH-NPs组64.33±4.0486.00±5.29110.00±4.00131.33±6.51154.33±8.39110.09<0.01t值-18.92-22.64-37.52-30.09-27.83——P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01——

2.3.3 体外超声成像 saline组无回声,F-PFH-NPs组及FBS-PFH-NPs组均呈中等回声(图2D)。纳米粒中Bi2S3浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/ml时，FBS-PFH-NPs组回声强度分别为(49.13±8.93)dB、(55.5±9.85)dB、(64.60±8.49)dB、(73.69±14.30)dB及(86.43±14.13)dB，随Bi2S3浓度增高回声强度逐渐增高(F=16.74，P<0.01)，且均高于F-PFH-NPs组[(14.39±3.14)dB，P均<0.01]。

表3 saline组与FBS-PFH-NPs组不同功率HIFU辐照下温度比较(℃，±s)

表3 saline组与FBS-PFH-NPs组不同功率HIFU辐照下温度比较(℃，±s)

组别HIFU功率(W)6090120150180F值P值saline组11.67±1.5317.00±2.0025.67±2.0829.67±3.5136.33±2.08——FBS-PFH-NPs组37.33±2.5268.33±2.5284.33±0.5889.67±1.5392.67±1.53440.69<0.01t值-15.10-27.66-47.04-27.14-37.79——P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01——

图1 激光共聚焦显微镜观察FBS-PFH-NPs与Hela细胞结合情况(×400) A.靶向组，大量红色FBS-PFH-NPs结合在Hela细胞周围； B、C.非靶向组(B)及抗体封闭组(C)均未见红色纳米粒与Hela细胞结合

3 讨论

目前多功能纳米粒是分子影像学发展的重点及热点，既可同时实现多种影像技术显影，又能携带药物、基因等对疾病进行治疗，具有广阔应用前景[5]。传统超声造影剂多为微米级，显影效果好，但很难穿过肿瘤血管内皮间隙[6]。本实验制备的FBS-PFH-NPs成功包裹Bi2S3，粒径约400 nm，可穿透血管内皮间隙而聚集于肿瘤组织，即被动靶向；同时FBS-PFH-NPs通过叶酸靶向作用可主动结合于细胞表面，即主动靶向。乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等上皮源性的恶性肿瘤细胞表面高表达叶酸受体，而正常组织几乎不表达，故叶酸可作为特异靶向肿瘤组织的靶点[7]；叶酸与肿瘤细胞特异性结合时，可开启受体介导的主动靶向策略，使纳米粒精准、大量到达肿瘤组织。本研究体外寻靶实验显示，靶向组大量FBS-PFH-NPs结合于宫颈癌Hela细胞周围，表明FBS-PFH-NPs具有主动靶向Hela细胞的能力；而非靶向组和抗体封闭组均未见纳米粒与细胞结合，提示加入游离叶酸后，叶酸受体被游离叶酸占据，阻断纳米粒与Hela细胞结合。

超声显像与组织声环境密切相关，而声环境又与纳米粒的声学特性相关，纳米粒构成越复杂，其与周围组织声阻抗差异越大，背向散射越显著，超声成像效果越好。造影剂外壳包裹可增加其表面张力，改善纳米粒的共振特性及振幅等声学特征，增强背向散射强度，提高超声显像效果[8]。FBS-PFH-NPs壳膜中包裹Bi2S3，使纳米粒声阻抗改变，超声成像效果提高。传统纳米粒半衰期短(3～15 min)，显影效果差，限制了其作为超声分子探针的应用[9]。本实验中，FBS-PFH-NPs包裹的PFH在室温下为液态，外界压力减小至气化压力阈值或温度升高至沸点以上时，可发生液气相转变而成为微气泡[10]，从而增强超声显影。FBS-PFH-NPs具有声致相变特性，可有利于解决传统超声造影剂穿透组织深度与显影能力的矛盾。本组结果显示，随HIFU功率增大，FBS-PFH-NPs温度及回声强度逐渐增强，相变的纳米粒数量逐渐增多、体积逐渐增大，原因可能为HIFU产生的热效应等促使PFH发生液气相变，相变的纳米粒协同增强HIFU的空化效应。

碘油是目前临床常用CT对比剂，但半衰期短，且具有潜在肾毒性及致过敏反应等缺点。Bi2S3中铋元素原子序数较大，且X线衰减系数高(约为碘油的5倍)，对X线有强大吸收能力，可提高CT成像对比度，同时具有低毒性、性价比高、粒子直径小、循环时间长及表面可修饰等优点[11]。本研究中saline组及F-PFH-NPs组CT图像均呈低密度，FBS-PFH-NPs组呈高密度，且随Bi2S3浓度增高，FBS-PFH-NPs组CT值逐渐增高。

综上所述，本研究成功制备的FBS-PFH-NPs具备靶向宫颈癌Hela细胞及增强CT/超声双模态显像的能力，但液气相变后气泡的大小难以控制，可能影响结果。今后将进一步优化实验条件，以期将相变后的微泡体积控制在一定范围内。