响应面法优化纤维素基载体固定糖化酶的研究

陈俊英，周航宇，唐焕妍，白 净，赵富强，李清亮

(1.郑州大学 化工与能源学院，河南 郑州450001；2.河南省杰出外籍科学家工作室，河南 郑州450001)

0 引言

糖化酶可将淀粉完全分解成葡萄糖［1-2］，广泛用于酒精、葡萄糖、抗生素、有机酸等物质的发酵生产.在酶催化反应中，游离酶具有难与底物分离，不能重复利用，易失活等缺点；而固定化酶易与底物分离，可重复使用，可连续生产，稳定性好［3-4］.酶的固定化通常分为载体结合法、交联法、包埋法及新型的定向固定法［5-9］，包埋法制备的固定化酶具有条件温和、酶包埋率不受保护剂及稳定剂的影响等优点，因此，本试验采用包埋法制备固定化酶，并且选择纤维素作为载体材料.与其他载体［10-14］相比，纤维素是具有一定空间结构的天然有机高分子多糖物质.纤维素疏松的孔隙以及长链结构有利于渗透和吸附大分子，具有生物相容性好，无毒，可降解，价格低廉，适合作为固定化酶的载体材料.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

糖化酶由河南天冠企业集团提供，原液酶活力约为100 000 U/mL.

海藻酸钠为化学纯，3，5-二硝基水杨酸、微晶纤维素、氯化钙、酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠、乙酸、结晶乙酸钠、氢氧化钠均为分析纯.

1.2 试验仪器

LDZF-30KB-Ⅲ型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；AL204电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；NDJ-79型旋转式黏度计，同济大学机械厂；恒温水浴振荡器；WFZ UV-2012 PC型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司.

1.3 测定方法

黏度测定:用NDJ-79型旋转式黏度计.

酶活测定方法:3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法［15-16］.

建立葡萄糖标准曲线y=3.395 3x+0.193 0，x为吸光度；y为葡萄糖浓度，mg/mL；得到的线性回归系数R2为0.999 2.

1.4 相关试剂与固定化酶的制备

(1)DNS试剂:准确称取3，5-二硝基水杨酸10 g，氢氧化钠10 g，酒石酸钾钠200 g，重蒸苯酚2 g，无水亚硫酸钠5 g.用500 mL水在45℃水浴中溶解至澄清后，放置冷却至室温.然后加水定容到1 000 mL，滤除杂质后移至棕色试剂瓶中避光干燥存放7 d后方可使用.

(2)葡萄糖溶液(10 mg/mL):称取一定质量的无水葡萄糖在103℃下烘干到质量恒定，精准测取1 g，用水溶解并定容至100 mL.

(3)葡萄糖标准溶液:分别吸取(2)中的葡萄糖溶液 0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 于10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀备用.

(4)2%的可溶性淀粉溶液(文中百分数不加特殊说明，均指质量百分数):称取淀粉20 g在蒸馏水中加热溶解，然后定容至1 000 mL.

(5)0.05 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6):称取质量为 6.7 g的乙酸钠，吸取2.6 mL冰乙酸，用水溶解并定容至1 000 mL，再使用pH计校正至pH=4.6即可.

(6)包埋糖化酶的纤维素-海藻酸钙凝胶［17-20］:测定经过杀菌的纤维素和海藻酸钠混合液黏度后，加入2.0 mL糖化酶原液搅拌均匀，取注射器将混合溶液滴加至氯化钙溶液中，反应2 h.滤出纤维素-海藻酸钙凝胶颗粒后用水洗几次，再次移入到氯化钙溶液中，在4℃冰箱中平衡12 h.取出后用蒸馏水洗涤多次，放入冰箱中过夜.

1.5 糖化酶酶活的测定

(1)原酶液酶活力测定:在50 mL锥形瓶中分别加入25.0 mL当天配置的可溶性淀粉溶液和5.0 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，先放入40℃的恒温槽预热5 min，后加入2.0 mL稀释500倍的酶液，准确反应1 h.反应结束后，加入0.2 mL 20%NaOH溶液终止反应，冷却至室温.将待测溶液稀释5倍后测定吸光度及葡萄糖含量.

(2)固定化糖化酶酶活力测定:测定方法同(1)，其中加入的待测固定化糖化酶量为2 g，反应结束后，及时分离固定化酶颗粒与反应液，冷却至室温.

糖化酶活力(U/mL)计算:

式中:y为根据吸光度由回归方程计算的含糖量，mg/mL；5为待测液的稀释倍数；32.2为反应体系的总体积，mL；2为加入了2 mL的酶液参加反应，mL；500为待测酶液的总稀释倍数.

式中:30.0为反应体系总体积，mL；2为包埋制固定化酶加入的酶液体积，mL；m总为固定化酶颗粒总质量，g；m为参与反应固定化酶颗粒质量，g.

1.6 对固定化酶活力影响的单因素试验研究

(1)纤维素-海藻酸钠混合液质量浓度的影响

取氯化钙溶液的质量浓度为20.0 mg/mL，包埋酶量为2.0 mL，取最合适的纤维素-海藻酸钠用量比例，设定纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度分别为 20.0、25.0、30.0、35.0、40.0 mg/mL，制备固定化酶，考察其对酶活的影响.

(2)氯化钙溶液质量浓度的影响

取包埋酶量为2.0 mL，按最佳纤维素-海藻酸钠用量比例，最适纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度，设定氯化钙溶液质量浓度分别为20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/mL，制备固定化酶，考察其对酶活的影响.

(3)纤维素、海藻酸钠质量比例的影响

取纤维素-海藻酸钠混合溶液和氯化钙溶液的质量浓度均为 20.0 mg/mL，包埋酶量为2.0 mL，设定纤维素-海藻酸钠的质量比分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2，按照上述方法制备固定化酶，测酶活，考察对酶活的影响.

1.7 响应面优化试验设计

本次试验采用Design-Expert.V8.0.6.1软件和BBD试验设计方法处理数据.根据单因素试验结果，试验因素选择纤维素-海藻酸钠用量比(A)、纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度(B，%)、氯化钙溶液质量浓度(C，%)，响应值用酶活力表示，设计三因素三水平的响应面优化试验，从而确定最优的固定化糖化酶条件.其中A取值为 3、2、1，B 取值为 2.0、2.5、3.0，C 取值为1.0、2.0、3.0.

2 结果与讨论

2.1 不同因素对固定化糖化酶活力的影响

2.1.1 纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度对固定化糖化酶活力的影响

由图1纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度对固定化糖化酶活力的影响可知，随着混合溶液质量浓度的增加，固定化酶活力呈现先增大后减小然后趋于平稳的趋势.质量浓度越大，形成的颗粒越大，而总的接触面变小；另外，混合溶液的质量浓度增大，海藻酸钠的含量也增加，使得颗粒结构紧凑，不利于活性位点的显现，造成酶活降低，但总的来说纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度对固定化糖化酶整体活力的影响较小.

2.1.2 氯化钙溶液质量浓度对固定化糖化酶颗粒形状及活力的影响

试验中氯化钙溶液质量浓度越大，滴入的复合溶液进入氯化钙溶液内部的阻力就越大.在滴加过程中，颗粒会漂浮在表面，形成障碍面，阻碍后续滴入溶液接触氯化钙.由于障碍面的存在，凝胶颗粒形状不均匀，或大或小，或不成球形，在不同浓度氯化钙溶液中固定化酶颗粒形状如图2所示.图3为对酶活力的影响.

图1 纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度对固定化糖化酶活力的影响Fig.1 Effects of mass concentration of the mixed solution on enzyme activity of immobilized glucoamylase

图2 在不同浓度氯化钙溶液中固定化酶颗粒形状Fig.2 The shapes of immobilized glucoamylase in the different concentrations of calcium chloride solution

由图3可知，随着氯化钙溶液质量浓度的增大，固定化后酶活力先增大后减小.氯化钙溶液质量浓度为2%时固定化糖化酶活力最好.海藻酸钠的分子结构会受离子浓度的影响，离子浓度越大，作用越大，在离子浓度过大时，酶活力受到影响而减小.

图3 氯化钙溶液质量浓度对固定化糖化酶活力的影响Fig.3 Effects of mass concentration of calcium chloride solution on enzyme activity of immobilized glucoamylase

2.1.3 纤维素-海藻酸钠质量比对固定化糖化酶活力的影响

图4为纤维素-海藻酸钠质量比对固定化糖化酶活力的影响.一定范围内，随着纤维素用量的增加，固定化糖化酶活力逐渐升高，当纤维素-海藻酸钠质量比超过2∶1时，固定化酶活力有所降低.海藻酸钠具有低浓度高黏度的性质，海藻酸钠比例高会影响所包埋酶活性位点的暴露，以致固定化后的糖化酶活力减少.而当海藻酸钠量太少时，则影响固定化酶的成球性能，难以得到相似的规则颗粒，且酶颗粒的硬度低、机械强度弱，颗粒形状小.

图4 纤维素-海藻酸钠质量比对固定化糖化酶活力的影响Fig.4 Effects of mix proportion of cellulose and sodium alginate

2.2 固定化糖化酶制备条件优化

以固定化酶酶活为响应值，响应面的试验方案和结果如表1所示.

表1 响应面试验矩阵及结果Tab.1 Results of response surface experiments

应用Design Expert 8.0.6.1软件对所得试验数据进行了多元回归拟合，得到下面的回归方程:

酶活力=2 747.51+317.17A+110.38B+322.49C+62.78AB+174.74AC+346.00BC-286.44A2-295.30B2-512.18C2.

表2为回归模型及方差分析结果.由表2可知，模型的P值为0.027 0，失拟项的值是0.054 0，模型拟合效果显著，且失拟项不显著说明模型拟合度好［21-22］.从纤维素-海藻酸钠质量比例、纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度、氯化钙溶液质量浓度的F值来看，影响酶活力值的强度由大到小依次为:氯化钙溶液质量浓度、纤维素-海藻酸钠质量比例、纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度.由响应面试验得到的模型复相关系数R2为0.920 6，校正后的复相关系数R2为0.777 6，表明模型的相关性较好；变异系数表示的是试验数据的离散程度，变异系数的值越大表示试验的可信度越小，本试验的变异系数(C.V.%)的值为11.77，由此说明试验操作是可靠的；信噪比的值大于4则表示模型可用于预测，本试验的信噪比为6.643，大于4，所以由软件得出的模型可用来预测［23-25］.

表2 回归模型及方差分析结果Tab.2 Results of regression model and variance analysis

图5为各因素交互作用对固定化酶活力影响的响应曲面.固定化糖化酶的最佳工艺条件是:纤维素-海藻酸钠用量比例为1.5∶1，纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度为2.80%，氯化钙溶液质量浓度为2.77%.

图5 各因素交互作用对固定化酶活力影响的响应曲面Fig.5 The interactive influences of the parameters on enzyme activity of immobilized glucoamylase

2.3 优化工艺验证试验

模型预测最优条件下理论酶活力为2 984 U/mL.在由软件优化得出的最优条件下制备固定化糖化酶，进行了三组平行验证性试验，测得的平均酶活力为2 880 U/mL，与模型预测理论值相近，可以看出模型是可靠的.

2.4 不同吸附情况对比

吸附试验步骤:取一定量经晾干7 h后的固定化糖化酶小球于5.0 mL原酶液中进行吸附试验，吸附时间为1 h；分离吸附后的固定化酶颗粒与酶液，自然晾干吸附后固定化酶颗粒2 h，称其质量.

分别取在最优方案下制备的固定化糖化酶颗粒2 g，吸附试验最优条件下制备的固定化糖化酶0.999 8 g，做重复使用试验，用于可溶性淀粉溶液的分解，每次反应1 h，多次进行反应.后用分光光度计测反应液的吸光度，计算其含糖量，考察固定化糖化酶分解淀粉的能力.固定化糖化酶的重复使用性试验结果如图6所示.

图6 固定化糖化酶重复性试验结果Fig.6 Reusability of immobilized glucoamylase

由图6可知，未吸附的固定化酶重复使用性较差，吸附后的固定化酶重复使用性较好.随着反应次数的增加，未吸附的淀粉量减少，反应液含糖量也减少.随着反应次数的增加，未吸附的固定化酶分解淀粉的能力快速降低，使用3次后固定化酶分解淀粉的能力仅为原来的48%.吸附后的固定化糖化酶分解淀粉的能力降低得较缓慢，有一段较平稳期，如2～8次，反应8次后固定化糖化酶分解淀粉的能力仍有原来的50%.

3 结论

在单因素试验的基础上，利用响应面试验优化了固定化糖化酶的工艺条件，优化后的工艺条件为:纤维素-海藻酸钠用量比例为1.5∶1，纤维素-海藻酸钠混合溶液质量浓度为2.80%，氯化钙溶液质量浓度为2.77%.验证试验所得酶活力为2 880 U/mL，与理论值2 984 U/mL较接近，表明该模型可用于试验的设计和预测.

本研究还对固定化酶进行了吸附酶液试验，实验表明仅用包埋法制备的固定化糖化酶重复使用性较差，包埋并且吸附酶液的固定化糖化酶重复使用性较好.