胱天蛋白酶募集域蛋白9⁃麦芽糖结合蛋白融合蛋白的原核表达及纯化

邓东灵，孔庆涛，胡青原，刘海波，魏天彪，黄善青，陈 浩，桑 红

0 引 言

胱天蛋白酶募集域蛋白9（caspase recruitment domain⁃containing protein 9，CARD9）是一个参与信号传导的重要衔接蛋白，由Bertin等［1］在2000年首次发现，定位于染色体9q34.3，cDNA全长2108 bp，编码536个氨基酸残基，产生相对分子质量为623 000的蛋白质。CARD9与免疫球蛋白Bcl 10和黏膜相关淋巴组织转运蛋白1（mucosa⁃associated lym⁃phoid tissue 1，MALT 1）结合形成CBM复合体，通过连接模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），产生相应的免疫反应来抵抗真菌、病毒及细菌的入侵，PRRs能有效地识别一些高度保守的微生物结构［2］。目前，人类发现了4种PRRs可以识别病原微生物，分别是：Toll样受体、C型凝集素受体、NOD样受体以及视黄酸诱导基因I样受体［3］。受体耦联后，PRRs会启动细胞内信号的传导，进行信息整合和介导免疫反应，CARD9通过衔接这些信号从而激活核因子⁃κB（nuclear factor⁃κB，NF⁃κB）、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinas⁃es，MAPK）等通路参与机体的固有免疫。鉴于CARD9在先天性免疫反应中扮演了重要角色，解析其蛋白结构进而阐明其功能显得格外重要。迄今，有关CARD9的研究，主要集中在体内免疫和动物实验等方面，关于其蛋白晶体结构的研究未见发表。晶体结构研究的前提是得到大量高纯度并且性质一致的蛋白质样品。介于CARD9原位表达量低，人源细胞难于大量培养［4］，原核细胞大肠埃希菌E.coliBL21（DE3）可大量表达目标蛋白［5］，单独的CARD9蛋白在E.coliBL21（DE3）中表达不可溶，麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）标签可以帮助融合蛋白可溶表达，本课题通过融合MBP标签和CARD9蛋白，在大肠埃希菌E.coliBL21（DE3）进行大量可溶性CARD9⁃MBP融合蛋白表达，再通过尝试不同层析柱纯化得到高纯蛋白，以期为进一步的晶体研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 LB培养基酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

1.2 主要试剂和仪器原核表达载体pET⁃30a（+）、E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）均由南京大学化学化工学院陈浩老师课题组实验室提供；NdeI、XhoI、EcoR I限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶购买自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购买自omega公司；蛋白质水解酶Trypsin为色谱纯产品；ÄKTATM purifier10蛋白质中高压层析色谱仪及各种色谱柱均购自GE公司。其余化学试剂均为国产分析纯产品。目的基因全合成及测序由金斯瑞（南京）生物科技有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的扩增 根据NCBI上人源CARD9基因序列（NG_021197.1）由金斯瑞（南京）生物科技有限公司进行目的基因片段的密码子优化并全合成，并设计扩增引物，上游引物为：5′⁃GAT⁃CAgaattcATGAGCGACTACGAGAACGACGAT⁃3′；下游引物为：5′⁃GATCActcgagTTAGCTACCCTCGG⁃TATCGGTGTTGT⁃3′，其中上游引物含EcoRI酶切位点，下游引物含XhoI酶切位点。根据实验室保存的pMCSG19质粒上MBP标签序列设计引物，上游引物为：5′⁃GATCAcatatgAAAATCGAAGAAGGTAAACTG⁃3′；下游引物为：5′⁃GATCAgaattcGGGTCCCTGAAAGAG⁃GACTTCAAGGGATCCGCCAGTCTGCGCGTCTTTCA⁃3′，其中上游引物含NdeI酶切位点，下游引物含EcoRI酶切位点。以合成的目的基因片段为模板PCR 扩增，反应体系：Phanta Max Super⁃Fidelity DNA Polymerase（1U/µL）1 µL、2 × Phanta Max Buf⁃fer 25 µL、dNTP Mix（2.5 mmol/L each）4 µL、模板DNA 1µL、前后引物各 0.4µL、ddH2O 18.2µL；反应条件如下：95℃预变性3 min、95℃变性15 s、57℃退火15 s、72℃延伸90 s，共35个循环，72℃再延伸5 min。分别用琼脂糖（10g/L）DNA胶检测PCR产物，并用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段。

1.3.2 重组质粒pET⁃30a(+)⁃CARD9⁃MBP的构建及鉴定 将上述切胶回收的产物及载体质粒pET⁃30a（+）进行双酶切反应，将酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳试验和切胶回收试验纯化后用T4 DNA连接酶于16℃进行过夜三片段连接反应作为实验组，构建pET⁃30a（+）⁃CARD9⁃MBP重组质粒。将实验组重组质粒和对照组（空载体质粒）分别转化至E.coliDH5α感受态细胞中，挑取7个实验组单克隆菌落和1个对照组单克隆菌落热裂解后作为模版进行PCR鉴定，随后接种至LB液体培养基中过夜培养，提取质粒进行酶切鉴定，将阳性克隆菌株送金斯瑞（南京）生物科技有限公司测序。

1.3.3 不同诱导条件下CARD9⁃MBP融合蛋白的表达 将测序正确的重组质粒pET⁃30a（+）⁃CARD9⁃MBP转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆菌落接种于液体LB培养基中（含30 ug/mL卡那霉素），37℃，250 r/min振荡培养至吸光度A600nm≈0.6时，分别加入终浓度为 0.01、0.1、1 mmol/L IPTG，并降低温度至30℃诱导表达4h，每隔2h取样，用于SDS⁃PAGE电泳实验分析。再次用相同的试验方法进行16℃的低温过夜诱导表达，分别取样，观察不同温度及不同IPTG浓度诱导条件下目的蛋白的表达情况及可溶性。

1.3.4 CARD9⁃MBP融合蛋白的MBP层析纯化用4倍柱体积的0.5mol/L NaOH清洗柱子，后用至少2个柱体积的MilliQ H2O润洗柱子，最后用100%A溶液（结合缓冲液）平衡柱子；将上清液用0.45µm膜过滤后循环上样；加载样品后，将柱子接至纯化仪，用5～10倍柱体积的100%A溶液（结合缓冲液）平衡柱子，收取样品至基线平稳，即所有未结合物质都被冲洗出柱子；用100%B溶液（洗脱缓冲液）冲洗柱子，由于蛋白质在紫外280nm处具有最大吸收，用2 mL EP管收集紫外A280吸收高于基线的样品，直至紫外吸收下降至基线附近；用5～10倍柱体积的100%A溶液（结合缓冲液）平衡柱子，待基线平稳后用MilliQ H2O润洗纯化系统，结束此次纯化；分别取样后行SDS⁃PAGE电泳实验，观察MBP麦芽糖层析柱对目的蛋白的纯化效果。

1.3.5 CARD9⁃MBP融合蛋白的蛋白酶酶切 取1 mL含杂蛋白少的样品至已灭菌的EP管中，加入终浓度为5 mmol/L的巯基乙醇（β⁃Me）和适宜浓度的HRV3C蛋白酶（实验室纯化保存），分别在酶切20、40、60、120min后取样进行SDS⁃PAGE电泳，回收条带进行Trypsin酶水解，通过MALDI⁃TOF质谱检测得到质谱信息，使用mascot软件通过对比NCBIprot蛋白质数据库对质谱检测结果进行鉴定。

1.3.6 CARD9⁃MBP融合蛋白的分子筛层析纯化先将A泵接入分子筛缓冲液中清洗A泵，然后以0.5 mL/min的流速将分子筛层析柱接入纯化系统中。以1 mL/min的流速先用一个柱体积的溶液冲洗层析柱，然后将样品注入系统通过分子筛层析纯化，设定参数为：柱子压力上限调为0.5 MPa，收集样品体积为1.8 mL/管，从30%柱体积即36 mL处开始收样。选取经MBP麦芽糖层析柱纯化后的样品进行收集合并，浓缩至2 mL左右，用0.22µm的滤膜过滤后注入2 mL进样环。后分别取样行SDS⁃PAGE电泳实验，观察分子筛层析对目的蛋白的纯化效果。

2 结 果

2.1 目的基因的扩增以设计好的引物分别扩增CARD9和MBP基因后，获得与预期片段大小（分别约为1600 bp和1000 bp）一致的PCR产物，见图1。

图1PCR扩增CARD9基因和MBP基因Figure 1 PCR amplification of CARD9 gene and MBP gene

2.2 重组质粒pET⁃30a(+)⁃CARD9⁃MBP的构建及鉴定将CARD9、MBP、pET⁃30a（+）按不同的酶切体系分别酶切2h后，可见酶切后CARD9、MBP基因位置无改变，pET⁃30a（+）由原来的螺旋和超螺旋结构被切成约为5000 bp大小的线性结构，见图2。PCR鉴定结果显示：对照组无相应的条带，实验组1号单克隆菌落为重组成功质粒。取实验组1号单克隆菌落菌株提取质粒进行酶切鉴定及基因测序鉴定，酶切鉴定可见未完全酶切的重组质粒（大小约为7600 bp）、CARD9（1600 bp）、MBP（1000 bp）、pET⁃30a（+）（5000 bp），基因测序结果也表明CARD9基因与MBP标签的编码序列成功插入至pET⁃30a（+）载体中，目的片段与已知序列完全一致，且无突变发生。见图3。

2.3 CARD9⁃MBP融合蛋白的表达将正确的重组质粒转化至E.coliBL21感受态细胞中，结果如图4所示，不同诱导条件下均可见单一蛋白表达条带，与预期相对分子质量大小105 000相符。30℃条件下，不同浓度的IPTG均能诱导目的蛋白的表达，并且上清、沉淀中均有目的蛋白，上清为主，较低浓度的IPTG（0.01 mmol/L）更利于目的蛋白的表达。16℃条件下，不同浓度的IPTG诱导表达下目的蛋白的表达量相差不大，其中0.01 mmol/L IPTG诱导表达下，沉淀中目的蛋白表达量高于上清，而1 mmol/L IPTG诱导表达下，目的蛋白在上清中的表达量则较高。

图2 片段及质粒酶切Figure 2 Enzymes restriction of fragment and plasmid

图3 重组质粒的PCR鉴定及酶切鉴定图Figure 3 PCR identification and enzymes restriction anal⁃ysis of the recombinant plasmid

2.4CARD9⁃MBP融合蛋白的MBP层析纯化 超声裂解后的上清液经MBP亲和层析纯化可见单一的紫外吸收峰，分别连续取样通过SDS⁃PAGE进行鉴定，在相对分子质量105 000处可见纯化后的CARD9⁃MBP融合蛋白。见图5。

2.5 CARD9⁃MBP融合蛋白的HRV3C蛋白酶酶切在相对分子质量412 000和623 000处可见蛋白条带，回收条带进行MALDI⁃TOF质谱检测，使用mascot软件通过对比NCBIprot蛋白质数据库对质谱检测结果进行鉴定分别为MBP标签和CARD9蛋白。见图6。

图4 不同诱导条件下目的蛋白的SDS⁃PAGE表达图Figure 4 SDS⁃PAGE analysis of induction expression un⁃der different conditions

图5MBP麦芽糖SDS⁃PAGE图Figure 5 SDS-PAGE analysis of MBP maltose chromatog⁃raphy column

2.6 CARD9⁃MBP融合蛋白的分子筛层析纯化经分子筛层析后可见一个较高的紫外吸收峰和前后2个较小的紫外吸收峰，较高的紫外吸收峰为CARD9⁃MBP融合蛋白，后面较低的紫外吸收峰为相对分子质量大小在44 000左右的杂蛋白。见图7。

图6HRV3C蛋白酶酶切后SDS⁃PAGE图Figure 6 SDS⁃PAGE analysis of different fraction after HRV3C protease enzymes restriction overnight

图7 分子筛层析柱纯化SDS⁃PAGE图Figure 7 SDS-PAGE analysis of gel filtration chromatog⁃raphy

3 讨 论

CARD9存在于体内多种组织中，如脾、肝、胸腺、骨髓、肺、外周血淋巴细胞等［6］，在抗原提呈细胞、树突状细胞、巨噬细胞中也存在高表达。CARD9可通过不同的信号通路而调控外界微生物的入侵，如通过激活MAPK参与调节NOD2向下游信号的传导从而抵抗细菌的入侵［7］。同样，CARD9也参与真菌感染性疾病，尤其是深部真菌感染性疾病，如疣状瓶霉、多主棒孢霉等［8⁃11］。Dectin⁃1 是目前研究最为全面的一个C型凝集素受体，主要识别真菌细胞壁碳水化合物中的β⁃（1，3）⁃葡萄糖，募集酪氨酸激酶Syk与ITAM基序结合，并激活CARD9连接Bcl 10和MALT 1形成CBM复合体，从而激活NF⁃ΚB通路并向下游传导信号，导致促炎因子等多种基因的表达。CARD9基因缺陷会导致信号传导受抑制，影响细胞因子的分泌从而降低人体对真菌的抵抗能力。其中，CARD9介导的信号传导主要影响固有免疫阶段，如刺激感染部位产生IFN⁃γ等细胞因子［12］。此外，CARD9基因缺陷还会导致树突状细胞诱导TH17细胞分化能力降低，从而使真菌感染迁延不愈［13］。除了感染性疾病以外，近期一项研究发现胃癌组织中CARD9的表达水平明显高于癌旁组织，具有抑制胃癌细胞增殖并促进胃癌细胞凋亡的功能。文中指出，由于CARD9定位于染色体9q34.3，这一区段在多肿瘤如神经母细胞瘤中易发生杂合缺失，这可能是导致肿瘤细胞丧失凋亡能力的关键［14］。另外，CARD9在结肠癌、肾癌、肝癌和淋巴瘤等疾病中也扮演着重要角色，但其中的具体机制 仍 需 进 一 步 的 研 究 来 阐 明［15⁃17］。 除 此 之 外 ，CARD9被发现在溃疡性结肠炎、心脏炎症和纤维化等疾病中也具有调控作用［18⁃19］。

由于本实验为原核表达，从NCBI上搜寻人源CARD9的氨基酸序列后将其转换成基因序列，再进行CARD9基因序列的密码子优化及全合成。根据蛋白纯化标签的不同性质，选择MBP标签进行融合表达，MBP由371个氨基酸残基组成，其相对分子质量大小约为42 000。MBP标签主要用于促进蛋白质的溶解性，具有促溶范围广、促溶效率高、且易于纯化等优点，可增加细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是对真核细胞蛋白质［20］。此外，MBP标签可增加目的蛋白的稳定性，与MBP标签分离后，目的蛋白很容易恢复其天然构象［21］。结果显示CARD9⁃MBP融合蛋白表达效率较高，不同诱导条件均能诱导目的蛋白的表达，且上清中的表达量较沉淀中明显要多。成功构建CARD9⁃MBP融合蛋白后进行目的蛋白的纯化，MBP与麦芽糖层析柱有较高的亲和力，利用此特性对融合蛋白进行初步纯化。通过SDS⁃PAGE电泳分析发现，上清液中含有大量目的蛋白，循环上柱后流出液里仍有未结合上柱的目的蛋白，这一现象可能与融合蛋白表达效率极高有关，导致麦芽糖层析柱没有结合全部含MBP标签的融合蛋白。用100%buffer B液（洗脱缓冲液）冲洗柱子后收取的紫外峰处样品中可见到大量与麦芽糖层析柱结合的CARD9⁃MBP融合蛋白，峰尖处样品中的CARD9⁃MBP融合蛋白最多，但杂蛋白也相对较多。吸取杂蛋白较少处的样品进行HRV3C蛋白酶酶切，在相对分子质量412000和623 000处可见蛋白条带，回收条带进行MALDI⁃TOF质谱检测，随后使用mascot软件通过对比NCBIprot蛋白质数据库对质谱检测结果进行鉴定分别为MBP标签和CARD9蛋白，证实了纯化得到的蛋白质确为构建表达的CARD9⁃MBP融合蛋白。后期将杂蛋白较少的样品合并浓缩并进行分子筛层析进一步纯化，这一过程可将相对分子质量大小在44 000左右的杂蛋白与CARD9⁃MBP融合蛋白分离开来。通过第二步纯化可以得到更纯的CARD9⁃MBP融合蛋白，目的蛋白下方存在一条浅蛋白带，我们推测为CARD9⁃MBP融合蛋白不同构象导致。由此通过组合麦芽糖层析柱和分子筛，每一升菌液可得到大约10mg较纯的融合蛋白，可用于快速筛选大量蛋白质晶体生长条件。

综上，本实验为后续的单体CARD9蛋白纯化奠定了试验基础，后期可进一步尝试其它的纯化条件或更换助溶标签，以期得到纯度更高的单体CARD9蛋白。