皂角刺中总黄酮含量测定及其抗氧化活性研究*

宋忠兴 ，唐志书 ，严邑萍 ，史鑫波 ，刘妍如 ，赵 鹏

（1.陕西兴盛德药业有限责任公司，陕西 铜川 727031； 2.陕西中医药大学·陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712046； 3.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000）

皂角刺又名皂荚刺、皂刺和天丁，为豆科植物皂荚Gleditsia sinensisLam.的干燥棘刺，始载于《本草衍义补遗》，具有消肿托毒、排脓、杀虫、抗癌之功效，临床常用于治疗痈疽初起和脓成不溃[1]。皂角刺资源丰富，主产于我国河南、山东、陕西等地区。现代研究发现，皂角刺中含有黄酮类、萜类、甾体类、酚酸类等多种化学成分[2-3]，具有良好的抗肿瘤、抗菌、免疫调节等作用[4-5]，但其化学成分与含量测定方面的研究很少，中国药典也未对其提取方法和含量测定进行规定。我国对皂角刺的研究主要在于化学成分和临床药理方面[6]，皂角刺中黄酮类成分为其抗肿瘤的主要活性成分，芦丁则是其中的活性成分之一。为控制皂角刺质量及研究其活性，本试验中以芦丁为对照品，采用紫外-可见分光光度法，对皂角刺醇提物和水提物中总黄酮的含量进行测定[7-9]。同时，采用体外抗氧化方法对不同提取物进行评价，为合理开发皂角刺相关制剂及产品提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CPD225D型电子分析天平（赛多利斯科学仪器<北京>有限公司）；FW-1000AD型高速粉碎机（天津鑫博得仪器有限公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；101-1型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；UV-2600型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试药

皂角刺所用药材采自陕西，经陕西中医药大学白吉庆教授鉴定为豆科植物皂荚Gleditsia sinensisLam.的干燥棘刺，药材标本存放于陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心；芦丁对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号为wkq16101104，纯度大于98%）；总抗氧化能力检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号为S0116）；试验用试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 原药材前处理

将皂角刺药材放入烘箱60℃干燥3 h，取200 g粉碎，过3号筛，得皂角刺粗粉。干燥至恒重，冷却，备用。

2.2 提取方法

2.2.1 回流提取法[10]

皂角刺加热回流醇提物：称取5.0 g（平行3组）药粉，精密称定，过3号筛，置250 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇150 mL回流提取2 h，滤过，水浴蒸干，残渣用50%乙醇溶解，溶液转移至25 mL容量瓶中，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

皂角刺加热回流水提物：操作同前，仅回流时所加液体由70%乙醇换为水。

2.2.2 超声提取法[11]

皂角刺超声醇提物：称取5.0 g（平行3组）药粉，精密称定，过3号筛，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇75 mL，超声（功率为250 W，频率为40 kHz，下同）处理30 min，滤过，残渣加70%乙醇75 mL，超声处理30 min，合并滤液，滤液水浴蒸干，残渣溶于50%乙醇，将溶液转移至25 mL容量瓶中，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

皂角刺超声水提物：操作同前，仅超声时所加液体由70%乙醇换为水。

2.3 总黄酮含量测定

2.3.1 对照品溶液制备

取120℃干燥至恒重的芦丁对照品5.5 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加50%乙醇10 mL，超声溶解，加50%乙醇定容，摇匀，得质量浓度为0.22 g/L的对照品溶液。

2.3.2 最大吸收波长选择

精密量取对照品溶液3 mL，置10 mL具塞试管中，加5%亚硝酸钠溶液 0.3 mL，摇匀，静置 6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入1 mol/L氢氧化钠溶液4mL，用50%乙醇定容，摇匀，静置15 min。置比色皿中，参照空白试剂，并在200～800 nm波长范围内扫描。结果表明，芦丁在510 nm波长处有最大吸收，故选定检测波长为510 nm[7]。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取对照品溶液 0，0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00 mL，其余操作同 2.3.2 项下“置比色皿中”前，以第一份作为空白对照，于510 nm波长处测定吸光度[7]。以吸光度（Y）为纵坐标、芦丁质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=13.912X-0.007 1，r=0.999 8（n=7）。结 果表明，芦丁质量浓度在0.005 5～0.088 0 g/L范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：日内精密度，取皂角刺加热回流水提物供试品溶液适量，按2.3.2项下方法操作，1 d内连续测定6次，测得吸光度的RSD为1.47%（n=6）；日间精密度，取皂角刺加热回流水提物供试品溶液适量，按2.3.2项下方法操作，连续测定3 d，测得吸光度的RSD为0.96%（n=3）。结果表明，仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取皂角刺加热回流水提物供试品溶液适量，于室温下分别放置 0，10，20，30，40 min 时测定吸光度。结果的RSD为2.00%（n=5），表明室温下供试品溶液在40 min内稳定。

重复性试验：另取同一批皂角刺药材粉末6份，每份约5 g，按2.2项下回流水提物方法提取，依法测定。结果的RSD为1.33%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的皂角刺样品6份，精密称定，均分为3组，分别按样品中黄酮含量80%，100%，120%的比例加入芦丁对照品溶液，依法进行样品制备及含量测定，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 芦丁加样回收试验结果（n=6）

2.3.4 样品含量测定

称取皂角刺药材粉末约5 g，精密称定，依法进行样品制备及含量测定。结果不同提取物中总黄酮的含量有一定差异，总黄酮含量排序依次为超声醇提物（1.38%）>回流醇提物（1.35%）>回流水提物（0.76%）>超声水提物（0.33%），故可选择总黄酮含量最高的超声醇提法提取皂角刺总黄酮。

2.4 皂角刺总黄酮抗氧化活性测定

2.4.1 溶液制备

标准品溶液：取27.8 mg总抗氧化能力（T-AOC）测试盒中的FeSO4-7H2O适量，以水溶解并定容至1 mL，此时浓度为 100 mol/L，以水稀释至 0.15，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mmol/L。

FRAP工作液：按试剂盒中的试剂一∶试剂二∶试剂三（10 ∶1 ∶1，V/V/V）混匀充分，避光 37 ℃孵育，现用现配，2 h内用完。

2.4.2 清除Fe3+活性测定

在96孔板中分别标定空白孔、标准孔、测定孔，加相应溶液各5 μL，再分别加入FRAP工作液180 μL。37℃下孵育3～5 min，检测波长为593 nm，记录吸光度。空白孔测定1次，测定孔和标准孔分别作3组对照，每组测3次。以标准品吸光度（Y）为纵坐标、标准品质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.275 4X+0.050 4（r=0.999 7）。按上述方程测定不同质量浓度样品吸光度，结果见表2。将上述各提取物样本测得的吸光度代入线性方程，计算总抗氧化能力。

表2 不同质量浓度样品吸光度

水提物和醇提物对Fe3+的清除作用分析结果见图1。可见，皂角刺加热回流水提物对Fe3+的清除作用较强，即总抗氧化能力最强。在总黄酮质量浓度为0.1～0.3 g/L范围内，不同提取物还原能力与浓度呈正相关。不同提取物皂角刺总黄酮对Fe3+的还原能力排序为回流水提物>超声水提物>回流醇提物>超声醇提物。

图1 不同提取物的总抗氧化能力趋势图

3 讨论

黄酮类化合物广泛存在于自然界各类植物中，具有多种生物活性[12]，为中药重要的化学成分。目前测定总黄酮的方法以紫外-可见分光光度法和高效液相色谱（HPLC）法多见，本研究中采用紫外-可见分光光度法测定皂角刺中总黄酮含量，方法准确、简单、可靠，可作为皂角刺药材中总黄酮含量的检测方法。回流醇提物和超声醇提物中总黄酮含量明显高于相应水提物。因此，建议在研究以黄酮为药效物质基础时，可以醇提物为主。

本研究结果显示，不同方法和溶剂提取的皂角刺中总黄酮的含量差异明显，但均有一定的抗氧化能力。FRAP为Fe3+还原抗氧化体系衡量总抗氧化能力指标[13]，目前鲜有皂角刺总黄酮的体外抗氧化研究报道，但实验研究发现，不同提取物对Fe3+的还原能力与其总黄酮的含量并无量效关系。同时，水提物的抗氧化能力均大于醇提物，表明皂角刺的抗氧化能力与提取溶剂和总黄酮含量均相关，初步推测其抗氧化作用也可能与来自总黄酮中具体的黄酮种类有关，但要确定总黄酮物质中哪种成分起到了抗氧化作用，还需要进一步深入研究。相关研究显示，其抗氧化活性物质可能是总黄酮、酚酸类和萜类等。回流水提物的抗氧化活性最好，可将其作为下一步的研究重点。目前已开展皂角刺中酚酸类和萜类等成分生物活性效应评价[14]，以期早日将其应用于临床[15]。