虹鳟荧光假单胞菌的分离鉴定

何文涛，谢洪霞

（1.甘肃省张掖中学，甘肃 张掖 734000；2.兰州市渔业技术推广中心，甘肃 兰州 730050）

赤皮病又称出血性腐败病，赤皮瘟、擦皮瘟等，已成为严重影响水产养殖业的细菌性疾病之一。研究表明，大鲵赤皮病的病原菌为荧光假单胞菌[1,2]。2010年，邓显文等[3]从发病的罗非鱼体内分离一株革兰氏阴性细菌，确定出赤皮病病原为荧光假单胞杆菌。沈晓静等[4]又从发病锦鲤体内分离出荧光假单胞杆菌。感染赤皮病的病鱼体表局部或大部分出血发炎，鳞片脱落，特别是鱼体两侧和腹部最为明显[4]。病鱼行动缓慢，反应迟钝，独游于水面，在鳞片脱落和鳍条腐烂处往往出现水霉菌寄生[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

IHNV病料（肝脏、胰脏），从甘肃省永登县某虹鳟养殖场采集。

细菌基因组DNA提取试剂盒，购自QIAGEN 公 司；DNA Marker、pMD-19T，T4 DNA连接酶、Ex Taq酶，购自TaKaRa生物科技有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司；PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离鉴定 在无菌工作台中取病鱼的肝脏、脾脏等病变组织，接种于血平板上，置于培养箱中28 ℃培养18～24 h。挑取单个菌落至液体培养基中，置于培养箱中28 ℃培养18～24 h，将液体培养物划线接种到血平板置于培养箱中28 ℃培养18～24 h，挑取单个菌落划线于血平板培养18～24 h得到纯菌种。于4 ℃保藏备用。纯化的细菌进行革兰氏染色，置于显微镜下进行细菌菌体观察。

1.2.2 16S rRNA基因克隆及序列分析 参照黄文明等[7]的方法进行。引物序列如下：

以提取的DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：Ex Taq酶25 μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5 μL，待检样品4 μL，加入灭菌ddH2O 18 μL至总体积为50 μL。PCR反应条件 ：98 ℃预变性2 min，94 ℃变性30s，60 ℃退火40 s，70 ℃延伸1 min，共31个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，再用DNA胶回收试剂盒进行回收。回收的PCR产物与pMD-19T载体连接，连接体系：PCR产物5 μL，pMD19-T 2 μL，5×T4 DNA 连 接 缓冲液2 μL，T4 DNA连接酶1 μL，混匀后置于4 ℃连接过夜。之后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将鉴定为阳性的质粒，用质粒提取试剂盒进行质粒提取，然后送往苏州金唯智生物科技有限公司测序。将测序结果置于NCBI上进行基因的同源性比对并分析，并用MEGA 7.0做系统进化树，对进化关系做进一步分析。

2 结果与分析

2.1 细菌形态学特征

由发病虹鳟肝脏、脾脏等病变组织分离纯化获得1株细菌，编号为GS株，在血平板上呈圆形、半透明、光滑、中央呈黄色，向四周颜色逐渐变淡。GS株革兰氏染色阴性，菌体短杆状、两端钝圆、无芽孢（如图1所示）。

图1 GS株菌落及菌体形态

2.2 16S rRNA基因克隆及序列分析

采用PCR方法克隆GS株的16S rRNA基因，进行琼脂糖凝胶电泳，分别可见扩增大小约为1 500 bp目的条带（如图2所示）。将提取的重组克隆载体测序，序列分析结果显示，目的片段为1 430 bp，与Genbank上已经发表的荧光假单胞杆菌代表菌株A11株、PFDWD株基因相对区域的核苷酸序列进行比较，同源性分别为99%、99%。选用9个荧光假单胞菌属标准参考菌株，使用MEGA7.0软件构建系统进化树，系统进化树分析如图3所示，分离菌株GS株与代表性菌株A11株、PFDWD株的遗传关系较近。

图2 GS株基因扩增结果

图3 GS株16S rRNA基因序列系统进化树

3 讨论

荧光假单胞菌为鱼类条件致病菌之一，常引起罗非鱼、鲤鱼，大西洋鲑、大鲵和虹鳟等多种水产动物赤皮病，造成饮用水、食物污染，导致人类呼吸、消化系统感染。目前通常用于荧光假单胞杆菌检测的方法为PCR方法[5]、扩增性rDNA酶切分析法[6]等诊断方法。本研究从暴发疫情的虹鳟肝脏、脾脏等病变器官中分离纯化出菌株GS株，经16S rRNA基因克隆测序和序列系统进化树分析，最终鉴定为荧光假单胞杆菌。本试验将传统细菌分离纯化的方法与分子生物学的方法相结合，准确分离诊断出了甘肃省永登地区爆发疫情的疫病为赤皮病，病原为荧光假单胞杆菌。该分离鉴定方法的建立，为该地区赤皮病的快速精确诊断提供了理论依据，为甘肃省永登地区赤皮病的防治提供了参考。