Rev-erb激动剂GSK4112对心肌梗死大鼠心肌损伤和心脏重塑的影响

周中淑,傅春江,邹 雪,唐 黎

(陆军军医大学第三附属医院心血管内科,重庆 400042;*通讯作者,E-mail:chunjiang510@sina.com)

心肌梗死是心血管疾病致死率最高的疾病之一[1]。心肌梗死是由于冠状动脉狭窄或痉挛,导致心肌急性或持续性缺血缺氧,心肌细胞死亡。心肌梗死后,即使冠脉再通,心肌细胞数目亦减少,影响心脏的射血功能[2]。白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种促炎症细胞因子均参与心肌重塑[3]。Rev-erb为核受体家族的成员,研究发现其具有调节生物机体组织代谢的作用。Rev-erb家族的蛋白C端缺乏能和配体结合的结构域[4],但是可以通过招募核受体阻抑因子和组蛋白去乙酰化酶3等来抑制Rev-erb蛋白的表达。组蛋白去乙酰化酶3是一种Rev-erb激动剂,是小分子化学探针[5]。黄国栋[6]研究发现Rev-erba和per1b对斑马鱼自噬基因的节律性具有重要的调控作用。Fontaine等[7]首先报道了Rev-erb和炎症之间具有相关性,Rev-erb能抑制Tlr4的表达,从而控制炎症信号。国外学者研究发现,在人类巨噬细胞中,用药理学方法增加Rev-erb的mRNA表达量后直接导致促炎症因子白细胞介素6的mRNA表达量下降[8-10]。本研究拟采用Rev-erb激动剂GSK4112处理心肌梗死大鼠,观察其对大鼠的心肌损伤和心脏重塑的影响,并探讨作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10周龄雄性SPF级Wistar大鼠48只(第三军医大学实验动物中心 生产许可证号:270M2),体质量(300±40)g。大鼠适应性饲养7 d(从购买时算起),随机分为假手术对照组(n=11)、假手术给药组(n=13)、实验对照组(n=12)和实验给药组(n=12)。假手术对照组和假手术给药组大鼠全部存活。实验对照组和实验给药组在结扎左冠状动脉前降支后分别有3只和2只大鼠死亡。

1.2 心肌梗死造模方法

两组大鼠均采用腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,沿左侧肋间切开胸廓。实验组,应用冠状动脉结扎建立心肌梗死模型[11]。假手术组仅切开胸廓和心包,不做结扎。模型建立成功后,饲养7 d后。实验组随机分为实验给药组和实验对照组,假手术组随机分为假手术给药组和假手术对照组;实验给药组和假手术给药组连续每日2次皮下注射REV-ERB激动剂GSK4112(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)100 μg/kg,实验对照组和假手术对照组同时注射相同量的生理盐水。冠状动脉结扎是最常选用的大鼠心肌梗死造模方法,其具体操作步骤为:将大鼠用氯氨酮麻醉后接上小动物呼吸机,经左侧第4肋间剪开皮肤,钝性分离肌肉组织,打开胸腔并剪开心包膜,挤压出心脏,在左心耳与肺动脉圆锥之间穿线,结扎左冠状动脉前降支(于分支的起点处约1-2 mm),用Ⅱ导生理记录仪记录心电图。

1.3 心肌梗死面积和梗死壁厚度的检测

在造模后2 h取标本,采用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉四组大鼠,然后取出心脏,分离心房及右心室。采用10%甲醇溶液固定后,石蜡切片(厚度5 μm),马松三色染色。从每个心脏的切片中随机选取三张,测量梗死面积和梗死壁厚度。其中心脏梗死面积的计算采用梗死壁的表面积占整个LV表面积比值进行表征。梗死壁的厚度即为梗死最薄区域厚度。

1.4 采用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

采用TUNEL染色阳性率表征心肌细胞凋亡情况,测定方法参照TUNEL试剂盒操作说明进行[12],凋亡心肌细胞在荧光显微镜下呈绿色。每个心脏中随机选取10张组织切片,随机选取每张切片中的5个视野,观察记录TUNEL阳性细胞数。按照下列公式计算得到心肌细胞的凋亡指数(%):

凋亡指数(%)=(心肌细胞核TUNEL阳性细胞数/视野内心肌细胞总数)×100%。

1.5 采用血管新生标志物CD31检测梗死边缘区血管新生情况

将随机选取10张心肌梗死组织切片,放入载玻片干燥后脱蜡[13]。采用40×EDTA抗原修复液进行修复后,用3%BSA封闭。然后采用1 ∶100稀释的CD31抗体孵育过夜。PBS缓冲液漂洗后,以1 ∶200稀释Cy3荧光抗体孵育1 h后漂洗3次。荧光封片剂封片后,显微镜观察5个视野并记录CD31阳性数目。

1.6 心脏重塑指标检测

测定左室短长轴之比(D/L),左室舒张末期内径(LVEDd),室间隔厚度(IVST),左室后壁厚度(LVPWT),从而按照下列公式计算得到左室心肌质量(LVM)及其指数(LVMI)[14]:

LVM(g)=1.04×[(LVEDd+LVPWT+IVST)3-LVEDd3]-13.6;

LVMI=(g/m2)=LVM/体表面积(BSA)。

1.7 检测心脏血清中IL-1β、IL-6和TNF-α三项炎症因子水平

血清IL-1β的检测采用双抗体放免法检测,血清IL-6的检测采用双抗体夹心ELISA法检测,血清TNF-α的检测采用双抗体夹心ELISA法检测。检测均按照试剂盒检测方法进行,试剂盒均购自南京建成科技有限公司。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 心肌梗死面积

假手术对照组和假手术给药组在解剖后，均未发现心肌梗死现象(见图1)。实验对照组心肌梗死位置为前间壁，梗死面积为(51.32±2.40)%；而实验给药组心肌梗死位置为前间壁，梗死面积为(43.96±1.75)%，低于实验对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明REV-ERB激动剂GSK4112能够降低心肌梗死大鼠的心肌梗死面积。

图1 大鼠心肌梗死面积Masson染色图Figure 1 Masson staining of myocardial infarction area in rats with different treatments

2.2 心室壁梗死厚度的检测

假手术对照组和假手术给药组在解剖后，均未发现心肌梗死现象，因此并无梗死壁。实验对照组心肌梗死壁厚度为(0.38±0.01)mm；而实验给药组心肌梗死壁厚度为(0.54±0.02)mm，高于实验对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明REV-ERB激动剂GSK4112能够增加心肌梗死大鼠的心肌梗死壁厚度。

2.3 室间壁心肌细胞凋亡情况

假手术对照组和假手术给药组大鼠心肌细胞只有少量细胞凋亡，凋亡率分别为(0.79±0.08)%和(0.81±0.06)%，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。实验对照组和实验给药组的心肌细胞凋亡率高于假手术对照组和假手术给药组，说明模型建立成功。实验对照组心肌细胞凋亡率高达(6.02±0.57)%；而实验给药组细胞凋亡率降低为(3.79±0.21)%，低于实验对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明REV-ERB激动剂GSK4112能够降低心肌梗死大鼠的心肌细胞凋亡率。

图2 大鼠的心肌细胞凋亡流式细胞结果Figure 2 Apoptotic rate of cardiac myocytes in rats by flow cytometry

2.4 梗死边缘区血管新生情况

为了明确Rev-erb激动剂GSK4112能否通过促血管新生改善心肌梗死后对心脏缺血性损伤和心脏重塑，采用新生血管标志物CD31反映血管新生情况，并进行定量分析。假手术对照组和假手术给药组大鼠并未发生心肌梗死和心肌损伤，因此并未发现血管新生情况。实验对照组心肌梗死边缘区血管密度为31.65±2.38，实验给药组心肌梗死边缘区血管密度为48.96±3.55，两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。说明Rev-erb激动剂GSK4112在大鼠机体内具有成血管功能，因此能够改善心肌梗死后心肌缺血损伤。

2.5 心脏重塑指标

假手术对照组和假手术给药组的左室短长轴之比(D/L)、左室舒张末期内径(LVEDd)、室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室心肌质量(LVM)及其指数(LVMI)间均差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。实验对照组的D/L、LVEDd、LVPWT、LVM和LVMI均高于假手术对照组和假手术给药组(P<0.05，见表1)。实验各组IVST与假手术各组均差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。实验给药组的D/L、LVEDd、LVPWT、LVM和LVMI均低于实验对照组(P<0.05，见表1)。而实验给药组的D/L、LVEDd和LVM均高于假手术对照组和假手术给药组(P<0.05)，LVPWT和LVMI则恢复至假手术组大鼠水平，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。以上结果说明Rev-erb激动剂GSK4112能够显著改善心肌梗死大鼠的心脏重塑指标，阻止心肌重塑。

2.6 炎症因子水平

假手术对照组和假手术给药组的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均差异无统计学意义。实验对照组炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于假手术对照组和假手术给药组(P<0.05,见表2)。相对于实验对照组,实验给药组炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均减低(P<0.05),但仍高于假手术对照组和假手术给药组(P<0.05,见表2)。说明REV-ERB激动剂GSK4112可抑制心肌梗死后的炎症反应。

分组D/LLVEDd(cm)IVST(cm)LVPWT(cm)LVW(g)LVMI(g/m2)假手术对照组0.45±0.094.15±0.280.93±0.061.04±0.08176.4±19.593.5±9.2假手术给药组0.48±0.094.08±0.300.98±0.051.11±0.17169.2±15.894.1±8.9实验对照组 0.79±0.09∗6.83±0.52∗0.94±0.071.48±0.13∗325.3±20.5∗ 168.5±8.8∗实验给药组 0.61±0.05∗#5.21±0.35∗#0.97±0.091.16±0.10∗229.1±10.3∗# 109.3±10.5∗

与假手术对照组比较,*P<0.05;与实验对照组比较,#P<0.05

分组 IL-1β IL-6TNF-α 假手术对照组11.7±0.9109.3±9.112.4±1.1假手术给药组10.6±0.9112.7±8.911.2±0.8实验对照组 19.5±1.2∗312.9±10.2∗32.9±2.2∗实验给药组 13.7±1.1∗#205.6±9.4∗#23.6±1.7∗#

与假手术对照组比较,*P<0.05;与实验对照组比较,#P<0.05

3 讨论

近现代医学研究发现,机体发生心肌梗死后会出现心肌功能丧失,进而导致存活的心肌缺血,因此心肌梗死会逐渐延伸,心肌功能下降[15],出现心脏重塑。研究证实,心脏重塑机会越多,心肌梗死后患者存活率越低[16]。因此阻止心肌梗死后的心脏重塑,对于提高患者的生存率具有极其重要的意义。心肌梗死后,大量的中性粒细胞和单核细胞聚集浸润造成的炎症会阻塞血管并释放氧自由基,造成内皮细胞损伤,从而导致心肌缺血损伤和缺血再灌注损伤[17]。此时肿瘤坏死因子TNF-α的mRNA过度表达,血清中TNF-α含量上升,引发机体心肌细胞的凋亡[18]。高度表达的白介素(IL)会通过改变血管内皮细胞表型,造成炎性细胞倾向于渗透至血管外。此时活化的核转录因子NF-κB可以通过诱导TNF-α和IL等炎症因子的表达,造成心肌炎症损伤。因此,若能够抑制核转录因子NF-κB的活化,降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,有助于改善心肌缺血性损伤[19,20]。

本研究显示,模型建立后假手术对照组11只大鼠在术后全部存活,假手术给药组也全部存活。实验对照组和实验给药组在结扎左冠状动脉前降支后分别有3只和2只死亡。假手术对照组和假手术给药组在解剖后,均未无心肌梗死现象。而实验给药组心肌梗死面积、细胞凋亡率、D/L、LVEDd、LVPWT、LVM、LVMI和炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于实验对照组(P<0.05),高于假手术对照组和假手术给药组(P<0.05)。实验给药组心肌梗死壁厚度和心肌梗死边缘区血管密度均高于实验对照组(P<0.05),低于假手术对照组和假手术给药组(P<0.05)。该结果说明Rev-erb激动剂GSK4112能够抑制心肌梗死后大鼠机体内炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA的表达,降低炎症因子含量,从而降低心肌梗死大鼠的心肌细胞凋亡率。另外Rev-erb激动剂GSK4112在大鼠机体内具有成血管功能。从而降低心肌梗死大鼠的心肌梗死面积、增加心肌梗死大鼠的心肌梗死壁厚度、改善心肌梗死后心肌缺血损伤、阻止心肌重塑。

综上所述,Rev-erb激动剂能够通过降低炎症因子的含量产生抗炎作用,进而改善心肌梗死后的心肌缺血性损伤和抑制心脏重塑。