不同剂量维生素D3对大鼠肾毒性的影响

薛润苗，杨文彬，史向华，陈磊，赵静宇，李百强，柴秋彦

（山西省医药与生命科学研究院，山西 太原 030006）

维生素D3（Vitamin D3，VD3）的经典生物学作用是调节钙磷平衡，维持骨骼健康[1]。目前，VD3的临床应用广泛，但长期安全剂量尚未确定，不良反应事件时有发生，特别是对肾功能有损害，可引起肾功能衰竭，导致死亡。肾脏是VD3代谢的重要器官，有学者指出血清VD3水平是多种慢性肾脏疾病进展的独立预测因素[2]。VD3肾毒性多因为使用不当，或是在治疗佝偻病的过程中反复大量使用所致[3]。为探讨VD3剂量与肾毒性之间的关系，本研究以大鼠为研究对象，比较观察不同剂量VD3对大鼠血清肾功能指标及肾组织病理学的影响。

1 材料

1.1 实验动物

健康SD大鼠100只，雄雌各半，体质量180～200 g，6周龄；SPF级，购自中国食品药品检定研究院实验动物资源中心，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2009-0017。饲养于山西省医药与生命科学研究院药理研究室屏障动物房，实验动物使用许可证号：SCXK(晋)2010-0005。适应性饲养一周后使用。

1.2 实验药品与试剂

VD3注射液（上海通用药业股份有限公司，批号：20100106，规格：7.5 mg/mL），根据需要稀释后使用；玉米油市售；2 mol/L硫酸；10%碘化钾溶液；0.002 mol/L 高锰酸钾溶液；10%硫酸锰溶液；3%钼酸铵溶液；0.5%淀粉溶液；甲醛(上海沪试，分析纯AR)；无水乙醇(北京试剂，优级纯GR)；0.9%氯化钠注射液(山东华鲁制药有限公司)；BUN测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20130416）；CRE测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20130416）；血Ca2+测定试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号：2010416）。

1.3 实验仪器设备

离心机；显微镜；电子天平(北京赛多利斯，BT2202S 型)；全自动五分类动物专用血液分析仪(HEMAVET 950 型)；全自动生化分析仪（SELECTA-E型，荷兰威图）；病理切片机（德国徕卡，TS6016+CV6030 型）；酶标仪（SPR-960型，长春赛诺迈德医学技术有限公司）。

2 方法

2.1 分组

将100只SD大鼠随机分为对照组、VD3低剂量组、VD3中剂量组、VD3大剂量组、VD3超大剂量组，各20只，雌雄各半；大鼠在实验前不禁食，不禁水。

2.2 维生素D3的配制

取标示浓度为7.5 mg/mL的VD3注射液，采用等量递增稀释法，以玉米油为溶剂分别配成所需浓度的VD3溶液（按照给药剂量进行换算配制，低、中、高、超高剂量组分别给药20 IU/kg、80 IU/kg、200 IU/kg、800 IU/kg），每天在灌胃前新鲜配制。

2.3 动物给药方式、剂量和时程

采用常规灌胃方式给药，VD3不同剂量组给予配制好的VD3溶液。每日灌胃（ig）一次，给药体积为0.5 mL/100g；连续6周。对照组给予同体积的生理盐水。

2.4 标本采集

2.4.1 血清样本采集： 禁食过夜后称量体质量，以乙醚麻醉大鼠，腹主动脉采血，血样在室温下以3 000 r/min离心10 min，取血清4℃条件下保存。

2.4.2 光镜标本采集： 采血后放血处死大鼠，剪开腹腔，取左肾横切，右肾纵切，在冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，于10%福尔马林溶液固定，24 h后换液，48 h后取材常规脱水、石蜡包埋，做成4 µm厚的切片，HE染色后行光镜检查。

2.5 样本测定

2.5.1 体质量测定： 灌胃前、灌胃3 w、6 w后分别以感量1/100电子天平称量各组大鼠体质量；

2.5.2 血清生化指标测定： 利用全自动生化仪测定各组血清尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)及Ca2+含量（按试剂盒说明测定）。

2.5.3 肾组织病理学检： 光镜下观察肾小球、肾小管上皮细胞的形态结构并拍照记录。

2.6 统计学分析

运用SPSS 19.0统计学软件分析数据，计量资料以“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，并进行方差齐性检验，组内比较采用最小显著差(LSD)法，P＜0.05为差异有统 计学意义。

3 结果

3.1 VD3对各组大鼠体质量的影响

灌胃6 w后，各剂量组雌性大鼠体质量同对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；各剂量组雄性大鼠体质量均大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、表2。

3.2 VD3对大鼠血清BUN、CRE及Ca2+含量的影响

五组BUN和CRE比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；VD3超大剂量组血清Ca2+含量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表1 VD3对各组雌性大鼠体质量的影响

表2 VD3对各组雄性大鼠体质量的影响

表3 VD3对大鼠血清BUN、CRE及Ca2+的影响

图1 VD3对大鼠肾脏组织病理学变化的影响（HE染色 10×20）

3.3 VD3对各组大鼠肾组织病理学的影响

与对照组比较，VD3各剂量组肾组织光镜下观察均没有显著改变。

4 讨论

VD3作为脂溶性物质，摄入剂量过大、应用时间过长可造成中毒。临床上VD3中毒诊断的主要依据为大剂量VD3摄入史、临床表现、血清25（OH）D3水平增高以及血清钙升高等[4]。VD3过量致25（OH）D3水平升高，但未导致高钙血症时，一般无任何临床表现。只有当血钙升高时，才出现一系列高钙血症的临床表现，VD3中毒相关的症状和表现与患者的年龄、血清钙浓度及高钙血症的持续时间等密切相关[5]。VD3中毒可引起肾损害，因高钙血症的程度和病情发展快慢而各异[6]。

本实验中持续给予大鼠不同剂量VD3，通过观察大鼠体质量变化、血中BUN、CRE、Ca2+含量、肾脏病理切片等，探讨不同剂量VD3对大鼠肾毒性的影响。体质量增长是反映实验动物一般生理状况的重要指标，特别是在评价药物毒性的实验中，体质量增长是必需考察的项目。本研究结果显示，VD3用药6周，VD3各剂量组雄性大鼠体质量均大于对照组；说明VD3对大鼠的身体造成了一定程度的损伤，生理状态发生改变。

本研究结果显示五组血清BUN、CRE比较无明显差异。课题组前期通过透射电子显微镜观察大鼠肾组织超微结构发现，用药6周时，与对照组比较，VD3各剂量组对肾小球组织结构的影响以增生为主[7]。

血清Ca2+升高可以使大量钙离子沉积于动物体内多种组织器官，造成器官功能障碍甚至衰竭，故血清钙离子的含量，是衡量中毒的敏感指标。本研究结果显示，超大剂量组血清Ca2+含量明显高于对照组，差异有统计学意义。说明VD3达到800 IU/kg时会使大鼠的血钙水平显著提高，产生毒性。

综上所述，VD3在800 IU/kg给药剂量，会引起大鼠血清Ca2+含量明显升高，但肾组织结构改变不大，对临床合理使用VD3有重要的参考和指导意义。