浅析透射电子显微镜在生物学科中的应用①

李 叶 黄华平 张新春 崔艳梅 邓 睿 林培群

(1 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南海口571101;

2 农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室 海南儋州571737)

透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM），以下简称透射电镜，是以波长极短的电子束作为照明源，用电磁透镜聚焦成像的一种高分辨、高放大倍数的电子光学仪器，被广泛应用于材料、医学、生命科学等研究领域。它按加速电压分为低压透射电镜（＜120 Kv），高压透射电镜（200～400 Kv）和超高压透射电镜（＞400 Kv）；按照明系统分为普通透射电镜和场发射透射电镜；按成像系统分为低分辨率和高分辨率。目前主要商品透射电子显微镜生产厂家包括日本日立（Hitachi）公司、日本电子（JEM）公司、荷兰菲律普（Philips）公司、德国西门子（Siemens）公司、英国联合（AEI）电气公司等，高性能多用途的透射电镜也不断更新，如扫描透射电镜、分析电镜、场发射电镜、超高压电镜、球差校正电镜、光电联用电镜、冷冻电镜、原子力显微镜等。

人类对于生物结构，最初只能在肉眼观察所及的范围内建立起早期的形态研究。17 世纪光学显微镜的发明，使人们看到了细胞和细菌的形态结构，并促进了细胞学的建立和发展，使人类对生物微观世界的认识发生了一次飞跃。20 世纪30年代，科学家在光学显微镜的基础上研制出了电子显微镜，使人类充分认识到物质世界的本质和奥妙，明白了结构与功能的相互关系。近年来，随着科学技术和生产实践的发展，电子显微镜在结构、功能和电子显微技术方面得到不断改进、更新和完善，电镜观察的分辨率可达0.20 nm。电子显微成像技术将人们对生物体细胞结构的观察推到亚细胞水平，可直接观察到生物细胞内各种细胞器和膜系统、病毒粒子及大分子物质的形态结构。这不仅丰富了人们对微观世界的认识，也大大推动了生物学中许多科研领域的发展，且透射电镜的自动化程度也不断提高，操作界面越来越简单，使透射电镜成为研究生物组织、细胞及细胞器超微结构观察的重要工具之一，在生物科学研究中发挥了极为重要的作用。本文以中国热带农业科学院环境与植物保护研究所的日立HT-7700 型透射电镜为例，介绍透射电镜的成像原理、生物样品制备以及在生物学科中的应用，以期为电镜初学者及农业科技工作者提供参考。

1 透射电镜的成像原理

透射电镜成像是通过电子枪发出高速电子束经1～2 级聚光镜会聚后均匀照射到样品的某一待观察微小区上，入射电子与样品会发生碰撞与非碰撞，由于样品很薄（电子的穿透能力很弱，因此样品必须很薄），大部分电子穿透样品，其强度分布与所观察样品区的形貌、组织、结构一一对应。投射出样品的电子经过物镜、中间镜和投影镜的三级磁透镜放大投射在观察图像的荧光屏上，荧光屏把电子强度分布转化为人眼可见的光强分布，于是在荧光屏上显出与样品形貌、组织、结构相应的图像以供使用者观察［1]。透射电镜光路与成像见图1。

2 透射电镜生物样本的制备

透射电镜应用于生物样本式样分析，样品制备技术是准确观察细胞内外超微结构的关键控制因素。生物样本的电镜制备技术复杂、繁琐，环节很多，往往一环失败都有全局皆败的可能，如生物样品制备技术出了问题，会造成各种形态假象，影响观察结果的诊断［2]。因此必须了解每一技术环节的原理，严格按实验流程操作才能得到高质量的电镜结果。

图1 透射电镜光路与成像示意图

超薄切片技术已成为最基本、最通用的透射电镜生物样本制备技术。其制样过程主要包括以下步骤：取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋、超薄切片、染色等过程。在进行具体生物样本的透射电镜样品制备过程中，需要考察不同样品的结构、化学成分及水分含量等信息，结合生物样本高度非均匀性的特点，优化合理的制样方法，尽可能减少样品前处理步骤，减少外源化学物对样本组织的干扰，避免造成了假象。

3 透射电镜在生物学科中的应用

3.1 在植物学研究中的应用

应用透射电镜观察植物组织的超微结构，研究器官的形态发育过程中内部结构变化，观察其组织分化、生长发育过程，探讨其形态结构变化的机理及其结构发育，揭示植物结构与功能关系，为改善植物功能和提高植物产量提供理论依据；应用透射电镜技术比较同一种植物或不同中植物生长在不同生态条件下其内部的超微结构变化的规律，观察其探索植物的结构及形成过程与生长环境的相互关系，为经济作物提高栽培技术提供依据。

吴凯等［3]综述了逆境（如盐渍、干旱、低温、重金属等）作用对植物细胞超微结构的损伤效应，探讨植物受环境胁迫后其细胞超微结构的变化规律，为植物的受损机理以及抗逆研究提供细胞学证据。

王宁［4]对樟树、杨凤仙［5]对棉花、周蕴薇［6]对翠南报春及葛秀秀等［7]对几种植物的抗寒性研究发现，在低温胁迫过程中，植物叶肉细胞中叶绿体的结构首先发生变化，为北方地区耐寒植物的引种提供理论依据。陈健辉等［8]利用透射电镜对不同耐旱性大麦品种在干旱胁迫下，比较叶片细胞中叶绿体等细胞器超微结构的变化规律，揭示了不同耐旱性大麦品种在形态结构上的特性，为大麦品种的选育提供理论参考。龚明等［9]利用透射电镜技术研究了耐盐的大麦和不耐盐的小麦幼苗在NoCI 胁迫下叶片脂质过氧化作用、膜系统伤害、叶肉细胞超微结构变化三者之间的关系。徐丽萍等［10]运用电镜技术对东京野茉莉雌雄芯花粉、胚珠的珠被细胞超微结构进行观察研究，发现良好的的花粉细胞内细胞质浓厚，含有高尔基体，大量的线粒体，较多的高电子致密物质，淀粉粒等物质，而败育的花粉、内部物质和结构松散，里面有些大的空泡，花粉壁外壁突起，内壁也相对薄。沈显生等［11]利用透射电镜对长梗苦草的花粉进行超微观察，研究苦草植物的形态结构、花粉萌发机理，胚胎发育过程，中间亲缘关系，为开发利用资源植物。

花生叶片在受高浓度NACL 胁迫后，叶绿体的基粒片层和基粒类囊体排列打破原有的秩序发生紊乱，失去原有整齐有序叶绿体长轴方向平行排列的状态，部分类囊体开始解体，甚至不存在（图2-b 箭头所示）；在低浓度NACL 胁迫后，叶绿体多呈长椭圆形或梭形靠近质膜分布于细胞质中，片层丰富整齐，结构层次分明。基粒片层及其上基粒内囊体较整齐有序沿叶绿体长轴方向平行排列，基粒内囊体和基质片层具有完整清晰的膜系统，排列有序（图2-a 箭头所示）。槟榔病叶的超微结构观察结果显示：叶绿体从原来的规则梭形膨胀扭曲变为近球状，外膜已完全消失，基粒片层和基粒类囊体排列打破原有的秩序发生紊乱，失去原有整齐有序叶绿体长轴方向平行排列的状态，较多基粒出现弯曲、膨胀（图3 箭头所示）；线粒体外膜轮廓清晰完整，但内部嵴消失不见，出现空洞现象（图3 箭头所示）。利用透射电镜技术研究荔枝不同时期体胚发育的过程发现，早期子叶细胞内含物较丰富，细胞核较多，细胞代谢活跃（图4-a）；成熟期子叶胚细胞形状规则，液泡增多，细胞壁厚，细胞核大并可见核仁（图4-b）。

图2 不同NACL处理浓度对花生幼苗叶片细胞超微结构的影响

图3 槟榔病叶超微结构观察示例。

图4 透射电镜技术研究荔枝不同时期体胚发育的过程

3.2 昆虫学研究中的应用

应用透射电镜观察昆虫的器官和组织超微形态，研究昆虫超微结构与生理功能的关系，触角感觉器的种类，分布和生理功能，提高对其微小器官的辨别能力、提高分类水平，同时进一步分析器官的作用，对昆虫的外部形态进行特征描述和比较，研究其形状变化及其规律和结构的特征，从而加深理解它们在生理功能上的作用，为探索各种生命现象和生活规律提供依据，并为防治和消灭虫害，提供理论依据。

陈庆霄等［12]透射电子显微镜技术观察了蝎蛉科（Panorpidae）大双角蝎蛉［Dicerapa nor‐pamagna（Chou）]幼虫复眼的超微结构，并依据其结构特征推测长翅目幼虫独有的复眼很可能是全变态类昆虫的祖征，其他全变态类幼虫的侧单眼可能是由复眼演化来，为探讨长翅目幼虫复眼与其他全变态类幼虫侧单眼之间的进化关系提供依据。马菲等［13]利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对舞毒蛾［Lymantria dispar（L.）]成虫触角感器的形态结构特征进行了观察。结果表明，舞毒蛾雌、雄蛾触角上均存在4种感器，即毛形感器、锥形感器、腔锥形感器、刺形感器，其中毛形感器最发达。郭付振等［14]应用扫描与透射电子显微镜，对美棘蓟马成虫复眼的外部形态和内部超微结构进行观察。成虫复眼类型属于并列像眼，每个小眼由1个叠层的角膜、1个真晶锥体、8个视网膜细胞、1对初级色素细胞、数个次级色素细胞和基膜组成，晶体周围、视网膜色素细胞内和基膜处均含有丰富的色素颗粒。图5为蓟马复眼横切面超微结构示例；图6为瓢虫复眼横切面超微结构示例；图7 为蓟马触角超微结构 示例。

图5 蓟马复眼横切面超微结构

图6 瓢虫复眼横切面超微结构

图7 蓟马触角超微结构

3.3 在微生物学研究中的应用

应用透射电镜观察研究细菌、支原体等微生物的超微结构形态，研究病毒的结构和生长发育，也为新病毒、类病毒的发现和辨别提供科研手段；研究真菌、放线菌、细菌等的结构形态，对其分类，判别科属和判断病源等都有着重要意义，尤其对病菌的活动、孢子发芽、侵入寄主的方式等，均能获得较好的效果。

Ehrilch［15]通过反复观察小麦秆锈菌菌丝、吸器母细胞、吸器的结构，初步确定了锈菌微观结构的基本模式；Lessie［16]等、Berlin 等［17]观察发现，不同类型鞭毛菌的游动孢子在形态、细胞器的分布、鞭毛的着生位点方面存在明显差异，鞭毛中的微管排列以“9＋2”式为其结构特征；Littlefield［18-19]等首次描述了锈菌吸器的发育过程，并发现吸器在寄主细胞内的形成并未刺破寄主细胞质膜进入寄主原生质内，而是被下凹的寄主质膜将吸器与寄主原生质所隔开；李正男［20]采用透射电镜技术研究了感病植株组织内植原体粒子分布和粒子形态；胡清波等［21]借助透射电镜超微结构观察，揭示了柿树叶柄被炭疽病菌侵入的过程，为探索炭疽菌柿树的作用机理提供了新的观测视角；谢念铭等［22]在用电镜系统地观察大量的细菌超薄切片标本中，偶然发现了霍乱弧菌的多层外膜泡，钩端螺旋体的各种球状体，以及支原体的细胞内出芽；李赤等［23]使用香蕉枯萎病菌4 号小种粗毒素和纯品镰刀菌酸对新北蕉（耐病品种）和巴西蕉（感病品种）幼苗叶片进行处理，观察叶片超微结构发生的变化，证明了香蕉枯萎病菌的粗毒素中主要成分是镰刀菌酸；伏波等［24]通过电镜技术，研究测定了分离自小麦根部的植物内生枯草芽孢杆菌Em7 菌液对葡萄灰霉病菌［Botrytis cinereaPers.]的抑制作用及抑菌机理。

图8为细菌透射电镜观察结果示例。霜疫霉菌受苹果多酚处理后，细胞器内含物减少，大液泡被分隔成许多小液泡且数量增多与挤压变形（图9）；尖孢镰刀菌经挥发性的抑菌物质作用，细胞结构变形，细胞质体模糊（图10）。经药效处理后胶孢炭疽菌，细胞壁受损严重，线粒体膨胀，出现空泡化（图11）。图12中的左图为炭疽菌侵入寄主细胞，右图为炭疽菌在寄主细胞内定植。

图8 细菌透射电镜观察结果示例

图9 受苹果多酚处理后的霜疫霉菌超微结构变化

图10 尖孢镰刀菌经挥发性的抑菌物质作用后地变化

3.4 在病理学研究的应用

应用透射电镜对动、植物，昆虫的细胞，组织和器官的超微结构病变进行研究，可为防治提供科学依据。在病理电镜诊断方面，其具有直观、快速、可靠的特点，在动、植物病虫害防治中具有非常重要的作用。尤其在植物病毒、植原体等研究方面，透射电镜具有不可替代的作用，可以通过电镜技术，研究病毒的形态结构，基因组织结构及功能、病毒复制过程、病毒与寄主之产间的关系，观察细胞超微结构病变，为揭示病毒的本质最终解决病毒、病害问题奠定基础［25-26]。如在柑桔黄龙病的研究上，已通过电镜技术，研究清楚了黄龙病的病原及其侵染途径，为黄龙病的防治提供了科学依据［27-29]。研究战略物资橡胶树的死皮病，槟榔黄化病等成因、致病机理等具有关键性作用。洪键等［30]研究了烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒等30 余种植物病毒的形态结构及寄主细胞超微病变。图13 为不同形态病毒超微结构示例。

图11 经药效处理后胶孢炭疽菌细胞变化（箭头所示）

3.5 在土壤学研究中的应用

应用透射电镜直接观察土壤中粘土矿物形状、大小，土壤腐殖质粘土矿物的复合情况以及胶膜的胶质情况。电镜结合超薄切片技术，研究环境胁迫下微生物的形态特征变化、微生物与土壤固相组分的作用、微生物与微生物之间交互作用的超微结构特征；揭示土壤微生物与污染物的作用机制，跟踪环境污染物的转化和迁移特征；通过对植物细胞超微结构的观察，了解环境的污染情况以及污染物对生物体形成的影响机制，为保护人类的生存空间提供理论依据。

柳检等［31]通过TEM 观察了芹菜根细胞内Pb 的分布特征和植物体内Pb 形态转化过程，揭示了可食用蔬菜与Pb 作用的细胞机制及Pb 的吸收和转运过程，为准确评估食用蔬菜的健康风险提供了理论支撑。徐信兰等［32]对受不同污染梯度的几种植物叶片的电镜观察表明，重金属污染给植物细胞带来伤害，表现在细胞发生质壁分离，叶绿体、类囊体肿胀，片层结构不清楚或消失，这些变化直接影响植物的光合作用，对其生长发育带来不良影响；在细胞壁、叶泡膜上有重金属沉淀，这是植物耐重金属的一种机制。

3.6 在环境科学研究中的应用

图12 炭疽菌侵入寄主细胞（箭头所示）（左图） 及在寄主细胞内定植（箭头所示）（右图）

应用透射电镜观察大气粒子的形态结构，测定粒子的大小，对粒子所含成分进行检测，可以在微粒水平上得到有关大气粒子的知识，进而理解它们在环境中所起的作用，从而为探索各种大气环境问题的形成条件和机制提供重要的证据。Qian 等［33]利用复合薄膜法已能够检出粒子中所含的SO4-2和NO3-离子。钱公望［34]利用透射电镜技术，对中国广州的大气污染、南极粒子、日本山地的酸雾进行了初步观察。结果表明通过电子显微镜的微观分析，可以得到有关大气粒子详细的知识，进而理解它们在环境中所起的作用。

图13 不同形态病毒超微结构（经2%磷钨酸负染色）

4 结论与展望

透射电镜不能像光学显微镜一样，直接观察活体样品及经某些简单的方法制得的样品厚切片，它需对生物样品进行固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等处理。由于步骤繁琐，操作复杂，生物组织和和细胞结构形态很可能发生某些变化。因此，在用透射电子显微镜观察生物样品前必须适当处理，根据实验材料寻找合适的处理条件，使样品损失程度最小，以求获得较好的、较真实的观察结果［2]。在过去几十年中，为了使生物样品在处理过程中尽可能保持其自然形态与结构，以及其中的固有成分，技术人员不仅对电镜的结构进行了改进，还研制出了一些高性能的电子显微镜。此外，科技人员及电镜工作者还对生物样品的处理方法进行了不断的摸索，使其方法日趋完善。除目前广泛使用的戊二醛—锇酸双重固定方法外，一些新的技术与方法，如超低温冷冻置换固定技术、冰冻蚀刻技术、低温干燥技术及低温包埋技术等也已相续用于生物样品的处理。

近年来，电镜技术在生物中的应用已超越了单纯形态结构研究的范畴，与免疫学、细胞化学、放射性同位素标记等技术相结合，形成了免疫电镜技术、电镜细胞化学技术、放射自显影技术等，用于研究细胞内特定蛋白质、糖类等物质的定位与探索这些物质在细胞中的合成、转移以及其生理功能。将静止的形态学观察与动态生理功能研究相结合的新型电镜技术为生物学提供了新的方法与途径［35]。随着多功能电镜（包括超高压电镜）的更新换代和电子显微技术的发展以及制样方法的不断改进和完善，电子显微镜在生物科学研究中并将发挥更大的作用。