新的血小板活化诊断标志物sGPⅥ及其临床意义*

周雅君，曹陶

深圳大学第一附属医院、深圳市第二人民医院 1药学部，2肾内科(广东深圳 518000)

血小板在对血管损伤部位的原发性止血和血栓形成过程中发挥着重要的作用，监测血小板的异常活化对了解机体血栓的生成和病情的进展具有重要意义。血小板膜受体在不同的病理生理条件下可被不同的激动剂活化，从而形成血栓或参与炎症的发生[1]。血小板膜蛋白受体在药物、蛋白水解、剪切力或氧化还原作用下可活化，亦可脱落，从而导致跨膜血小板受体的不可逆清除。近年来，血小板糖蛋白(gluco protein，GP)Ⅵ的病理生理性脱落得到了广泛的关注和研究。在心血管疾病患者中，GPⅥ的脱落对血小板的黏附、活化及随后血管损伤或炎症部位血栓的形成具有重要的意义[1-2]。因此，本综述总结了GPⅥ脱落后在不同的血栓性疾病中的意义，期待在血栓性事件(如心肌梗死等)高危患者，缺血性中风和动脉粥样硬化等心血管疾病的治疗和诊断中，将GPⅥ作为一个具代表意义的诊疗相关靶点。

1 血小板表面GPⅥ

大多数GPⅥ分子以单体形式存在于静息的人血小板中，可溶性受体激动剂诱导的受体的二聚化，从而使血小板被胶原蛋白活化[3]。配体诱导的GPⅥ交联通过Src激酶Fyn和Lyn触发在其ITAMs的FcRγ链酪氨酸磷酸化。这导致随后的招募和随后的串联SH2结构域包含酪氨酸激酶Syk的活化，而这依次又启动一个下游信号级联反应，包含活化T细胞(LAT)的衔接蛋白和SH2结构域含有76 kD的白细胞蛋白(SLP-76)，并最终激活众多的效应分子，包括磷脂酶PLCγ2(PLCγ2)和磷酸肌醇3激酶(PI3K)。通过GPⅥ基本的信号通路被认为是通过其邻近的免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)包含的受体有如PECAM-1、CEACAM1或GVIb，这已被证明是作为GPⅥ/ FcRγ-链可介导的血小板负调节的信号转导。

GPⅥ通过胶原对血小板的活化是必不可少的，但同其他配体如层粘连蛋白亦可相互作用。当人类和小鼠血小板GPⅥ缺乏或功能受阻时，对胶原蛋白的激动无反应，导致部分黏附反应减弱、取消Ca2+的流出、颗粒的释放、聚集和促凝血反应，而其他激动剂活化血小板的反应强度不变，显示GPⅥ在血小板膜蛋白中的特殊性，及对富含胶原蛋白的损伤部位的血栓形成具有的基础性作用。

2 GPⅥ对血栓的必要性和对止血的非必要性

临床报道及实验研究均显示GPⅥ的缺失对正常止血功能来说影响不大[4-5]。只有少数患者GPⅥ缺陷，主要是由于自身抗体诱导受体损失。这些患者表现出轻微的出血紊乱疾病，胶原不能诱导其血小板产生聚集[6]。在基因敲除GPⅥ基因的小鼠[7]、FcRγ-链缺失无法表达GPⅥ的小鼠[8]和给予抗GPⅥ抗体的野生型小鼠均只显示出尾出血时间轻微延长。Grüner等[9]研究发现，缺失GPⅥ功能的小鼠可通过敏感性的G蛋白介导信号网络使整合素α2β1活化，其能部分地补偿GPⅥ功能的缺失。

与此形成鲜明对比，GPⅥ在止血过程中的作用相对较小，在体内介导血小板坚固的附着在受伤的动脉壁和随后的血栓形成过程中，此受体似乎发挥了主导作用。这首先在小鼠得到证实[10]，表现在封闭抗GPⅥ抗体的F(ab)片段和随后小鼠抗体诱导或遗传(GP6-/-，Fcer1g-/-)GPⅥ缺失模型中。GPⅥ的缺乏症抑制了ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块损伤后血栓的形成。临床研究显示，短暂性脑缺血和中风的患者血小板表面GPⅥ表达增加[11]，急性缺血性卒中患者检测到胞外结构域的可溶性GPⅥ(sGPⅥ)的水平升高，显示出GPⅥ在此部位的活化。

3 诱导血小板GPⅥ脱落的途径/因素

在一些研究血小板受体脱落的临床研究和动物模型中，均提供了发生GPⅥ体内脱落的证据[12-13]。胶原、CRP和蛇毒Convulxin,这些血小板GPⅥ的配体活化血小板后，导致一系列细胞内信号转导，进而通过蛋白水解的途径使GPⅥ胞外域脱落[14]，释放可溶性55 kD片段(sGPⅥ)，而其10 kD片段则仍残留在血小板膜上。GPⅥ的脱落亦可由脱落酶引起，其为一类内源性膜相关的蛋白酶。诱导GPⅥ脱落的主要脱落酶是金属蛋白酶(ADAM)家族的成员，ADAM10，其可对胞膜临近的GPⅥ胞外域部分进行剪切而导致脱落[15]。GPⅥ的脱落还可由N-乙基马来酰亚胺(NEM)、W7、PMA和线粒体解耦剂羰基氰化物3-氯苯肼(CCCP)、及血小板GPⅥ特异性受体激动剂或抗GPⅥ及抗血小板抗体[12，16-21]所诱导；但vWF诱导活化的GPIbα不能引起显著的GPⅥ的脱落，提示GPⅥ和GPIbα导致GPⅥ脱落的潜在机制不同。不论是否存在αⅡbβ3、GPIbα的表达活化或抑制细胞内信号传导，病理生理的剪切速率(3 000～10 000 s-1)均可诱导金属蛋白酶依赖GPⅥ胞外脱落[13，22]。GPⅥ胞外域脱落不仅可被诱导，亦可被抑制。GPⅥ剪切部位突变可导致脱落的被抑制[17]。EDTA、广谱金属蛋白酶抑制剂GM6001、和肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白酶抑制剂(TAPI)均可抑制金属蛋白酶依赖GPⅥ的脱落。

4 评估血小板GPⅥ脱落的方法及临床意义

目前，评估血小板GPⅥ的脱落可采用流式细胞术、蛋白印迹(Western blot)法、酶联免疫吸附法(ELISA)等进行检测。流式细胞术是应用相关的抗体检测GPⅥ胞外域的表达。Western blot可检测GPⅥ水解的程度和相关分子量蛋白水解片段的表达量。检测血浆中GPⅥ脱落的受体，众多实验室采用的是酶联免疫吸附法[12，19]，此方法较简便、快捷。利用光学或电阻抗进行的聚集检测GPⅥ激动剂(胶原、CRP)同样能检测GPⅥ的脱落，但这些方法并不能表达受体间精细的变化，且对血小板减少症的患者无应用意义。健康的人血浆含有可检测水平血小板源性可溶性受体的碎片如：GPIbα、GPV、sGPⅥ[23]。降低血小板表面的表达pGPⅥ可导致受体的脱落从而导致血小板活化，这同选择性的胶原诱导的GPⅥ依赖的聚集是相对应的。然而，膜相关的剩余GPⅥ的片段在健康人身上是检测不到的[17，24]。在另一方面，血浆sGPⅥ水平的升高也可能起作用作为血小板活化和GPⅥ脱落的潜在生物标志物。

sGPⅥ被认为是一种血小板活化标志物有几个原因:(1)它仅在血小板上表达；(2)血栓形成患者血浆sGPⅥ水平升高；(3)sGPⅥ的产生依赖于血小板活化；(4)血浆sGPⅥ水平不受性别和吸烟的影响[19，24]。如今利用sGPⅥ评估患者的血小板水平被临床广泛地应用。在心血管疾病中，已有研究显示sGPⅥ可作为诊断中风、稳定型心绞痛、急性冠脉综合征等疾病的标志物[25-28]，亦可作为判断服药前后血小板活化的指标。临床研究发现[29]服用抗Xa非抗维生素K口服抗凝药(抗Xa NOACs)阿哌沙班、利伐沙班和华法林，利用体外sGPⅥ评估抗血小板活性，提示NOACs具有抗血小板活性。83例整形外科的患者服用依度沙班以预防深静脉血栓(DVT)，术后患者在撤掉抗凝药后，检测D-二聚体对判断患者是否具深静脉血栓意义不大，但sGPⅥ的水平可评估患者DVT的风险[30]。活体肝移植术后sGPⅥ水平的变化则可评估血小板活化和血小板减少症之间的关系[31]。在痛风、痛风性关节炎和健康志愿者中，sGPⅥ水平可评估痛风患者或者痛风发作期时血小板活化状态，血浆sGPⅥ在血浆风湿性检验中呈阳性患者中为一显著的血小板活化标志物[32]。肝硬化患者同健康志愿者相比[33]，sGPⅥ水平显著升高，sGPⅥ水平升高同血小板数目具相关性，研究显示补偿性肝硬化时血小板的活化状态。相较于非肝切除术的肝硬化患者，sGPⅥ/血小板比例对肝硬化切除术组在肝切除术前后中均明显增高[34]。临床上两组队列比较研究发现，sGPⅥ较D-二聚体同病死率的相关性更密切，可预测脓毒症的进展和病死率[35]。艾滋病病毒携带者发生心肌梗死的风险与核苷酸逆转药物(逆转录酶抑制剂)的使用有关。艾滋病服药方案改变时(ABC/3TC)，sGPⅥ可发生显著变化，且变化同血小板功能的改变是一致的，其可作为艾滋病感染患者治疗风险的标志物[36]。众多研究表明GPⅥ可作为血小板活化的诊断标志物，但由于检测血小板活化的敏感性及其在血中清除率的手段有限[24]，因此，sGPⅥ仍需要开发简便、快捷、精密度高的检测方法和相关试剂。

5 展望

综上所述，各研究均表明血小板GPⅥ在不同疾病的诊断中均具有重要意义，但目前仍缺乏大型的队列研究和长期的跟踪调查研究。除需深入研究血小板特异性GPⅥ的结构活性、信号转导途径、GPⅥ脱落的机制以及诊断和检测技术的发展外，还需对患者sGPⅥ与疾病的发展和转归间的相关性、用药前后sGPⅥ的表达量变化进行对比研究，为GPⅥ作为新的血小板活化诊断标志物提供科学的理论依据。