LIN28/let-7与肿瘤作用机制的研究进展

柴洋 综述 谢明祥 审校

(1.遵义医科大学，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学附属医院神经外科，贵州 遵义 563003)

目前认为LIN28/let-7信号通路[1]在胚胎发育、炎症和代谢中的调控[2]与恶性肿瘤的产生和发展机制密切相关[3]。LIN 28适度表达与Oct 4、Sox 2和Nanog共同将人体成纤维细胞重组成多能干细胞，而LIN28过度表达则诱导细胞恶性变[4]。LIN28已被证明在let-7转录后调控中通过抑制let-7而致癌。据报道，LIN28在一些预后较差的肿瘤中高表达，如乳腺癌、恶性生殖细胞肿瘤、卵巢癌、B细胞淋巴瘤、肺癌和神经胶质瘤。并且与血清甲胎蛋白(AFP)水平升高、高级别肝癌发生以及结肠癌整体生存率降低、肿瘤复发可能性增加相关。 因此，深入研究LIN28/let-7通路的调控机制将为恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的策略。

1 LIN28与let-7的基本结构及功能

1.1LIN28 LIN28最早在秀丽隐杆线虫中被发现，其控制线虫时间和空间发育的多样性，突变将导致幼虫发育时间的紊乱[5]。LIN28广泛表达于胚胎干细胞，伴随RNA调控代谢过程[6]的RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)，介导RNA的成熟、转运、定位和翻译，可能存在多种RNA靶标，其表达缺陷会导致多种疾病发生。LIN28含有两个结合RNA的结构域，这两个结构域在动物中都是高度保守的。一个是氨基末端的冷休克结构域(CSD)，另一个是羧基末端的锌指结构域(ZKD)[7-8]。ZKD由两个串联的 CCHC(Cys-Cys-His-Cys)组成，即CCHC×2。LIN28依赖CSD和ZKD抑制miRNA家族let-7成熟来执行在干细胞功能、糖代谢、组织再生和肿瘤发生中的重要作用。LIN28有两种小于30 kDa的同源易构体：LIN28A和LIN28B，虽然分子结构不同，但具有相似的表达水平和功能，通过抑制let-7促进癌细胞的增殖、侵袭、转移和复发[9]。

1.2let-7 let-7是长度约20～23个nt(核苷酸)的非编码RMA(微小RNA，microRNA，miRNA，miR)，同样最先被发现于秀丽隐杆线虫中。调控未分化细胞向分化细胞的转化[10]。let-7家族的靶mRNA主要是癌基因，其在转录后水平与LIN28的mRNA特异性序列3’-UTR(3′非翻译区)结合，诱导靶mRNA剪切或阻遏其翻译，因而let-7行使着"抑癌基因"的功能。成熟let-7的家族成员有10个[11]，均由前体合成而来。首先，在细胞核中，let-7复制后经RNA聚合酶Ⅱ作用转录产生初级let-7(pri-let-7)；接着pri-let-7被酶—蛋白复合体RNase Ⅲ Drosha-DGCR8蛋白切割成前体let-7(pre-let-7)，pre-let-7是具有60～80个nt、3’-端有2个nt突出的发夹结构；最后pre-let-7经转运蛋白Exporting-5：RanGTP转运至细胞质后，被RNase Ⅲ Dicer再次切割，最后生成成熟let-7。

2 LIN28/let-7引起肿瘤的作用机制

2.1LIN28抑制let-7成熟的结构基础 LIN28与pre-let-7结合过程中氨基末端CSD和羧基末端ZKD相互配合，缺一不可。在由LIN28与pre-let-7的末端环区域(preE)形成的晶体结构中，pre-let-7 preE的loop环绕LIN28的CSD，pre-let-7的3’-stem GGAG模体与LIN28的ZKD结合[12]。在脊椎动物pre-let-7中存在高度保守的GGAG模体，这对于pre-let-7与LIN28的结合是非常重要的。GGAG发生突变可以解除LIN28阻断pre-let-7的成熟，并使TUT4[非经典的poly(A)聚合酶—末端转移酶4，末端尿嘧啶转移酶，terminal uridyly transderase]介导pre-let-7 oligo-尿苷化(寡核苷酸尿苷化)受损。LIN28 ZKD中的两个CCHC直接与pre-let-7 GGAG模体结合，并在RNA骨架中形成特征性扭结，在这种扭结构象中，LIN28的Y140非常关键，其位于A3G1之间，形成夹心状，并且与H162互相作用，形成扭结构象。pre-let-7的A3压紧G1与其形成氢键，有助于形成扭结构象。pre-let-7的G1和G4之间的氢键由ZKD的刚性部分氨基酸残基的羰基和氨酰基骨架介导，并且G1和G4插在了第一个CCHC中酪氨酸与组氨酸和第二个CCHC中组氨酸与蛋氨酸形成的疏水口袋中。LIN28的ZKD和pre-let-7的GGAG模体对于RNA结合pre-let-7和pre-let-7 oligo-尿苷化是必需的。虽然LIN28的ZKD可以特异性结合pre-let-7 GGAG模体，但是单独的ZKD不能与pre-let-7结合并阻断其成熟，需要CSD的参与。CSD能够影响LIN28与pre-let-7结合的亲和力和特异性。preE的loop环绕CSD，形成领带状，并且与ZKD和3’-stem GGAG模体结合的区域交叉形成领结。CSD的广泛特异性使LIN28能够识别let-7家族成员的前体。CSD影响和重塑靶RNA内部的二级结构。LIN28的CSD能够使pre-let-7双链stem-loop发生部分解链，然后封闭Dicer切割位点。CSD诱导的结构重塑对于LIN28 ZKD识别pre-let-7 GGAG模体可能很重要，其促进ZKD与3’-GGAG模体的结合。

研究表明，Dis312(3’-5’核酸外切酶)能够降解oligo-尿苷化的pre-let-7。Dis312是由一个核糖核酸酶Ⅱ结构域、2个CSD和一个CSD样S1结构域组成，CSD 和S1结构域对于Dis312结合并降解oligo-尿苷化的pre-let-7是非常重要的。

2.2LIN28抑制let-7成熟的机制及过程 LIN28阻断let-7成熟的机制都是通过与其pre-let-7结合而发挥作用的。当LIN28不存在时，TUT4和TUT7(Zcchc6)催化pre-let-7的1个nt 3’-突出端发生尿苷化(单核苷酸尿苷化，mono-尿苷化，mono-uridylation)形成具有2个nt 的3’-突出端。此后，Dicer通过它的PAZ结构阈识别2个nt的3’突出端切割pre-let-7形成成熟let-7。因此，在LIN28不存在的情况下，如果删除TUTs就会导致let-7水平下降，干扰let-7的功能。当LIN28存在时，TUT4和TUT7催化pre-let-7的2个nt的3’-突出端发生尿苷化(寡核苷酸尿苷化，oligo-尿苷化，oligo-uridylation)，Dicer就不能识别延长的3’突出端(>2个nt的3’突出端)，从而不能对pre-let-7切割并形成成熟let-7。并且在引入3’-5’核酸外切酶Dis312后，oligo-尿苷化的pre-let-7被降解。因此，在LIN28存在的情况下，pre-let-7更容易发生oligo-尿苷化，当与LIN28结合后，pre-let-7 preE的某些区域和双链stem的一部分变得更容易被单链特异性核酸酶切割。如果LIN28 CSD具有U-rich结合位点的优先性，那么CSD可以识别oligo(U)尾巴，此外，这可能通过打开pre-let-7的双链stem推动Dir312降解oligo(U)-pre-let-7。

2.3LIN28抑制let-7成熟导致肿瘤形成的特点 到目前为止，发现与LIN28/let-7相关的环路有：(1)ER-Src[13]/NF-κB[14]]/LIN28B/let-7/IL-6通路[15-16]；(2)Wnt-β-catenin[17]/LIN28/let-7[18-20]通路；(3)myc/LIN28B/let-7/HMGA2通路[21-26]。肿瘤基因组图谱(TCGA)[27]定义的三条与恶性肿瘤相关的主要途径RTK/RAS/PI3K信号通路、p53以及Rb抑癌通路都与LIN28有关，如p53可能增加let-7表达从而抑制LIN28。参与这些通路的上游基因，包括ras、ARF和CDK 4[28]，都与LIN28有关，LIN28已被证明参与了这三条途径中的每一条；此外，LIN 28是干细胞重编程因子，因此针对LIN 28的药物也可以靶向作用于恶性肿瘤干细胞。

放疗抵抗是恶性肿瘤的治疗障碍。研究表明，干扰LIN28以及过表达let-7a能够抑制放疗抵抗，且对指导化疗也有重要意义[29]。如let-7低表达的患者接受基于顺铂、紫杉醇的化疗方案预后良好，高表达的患者对于相同的化疗方案预后很差，然而单独使用顺铂则预后良好。抗凋亡蛋白bcl-xL[30]是let-7的靶基因，并且其在耐药株中的表达水平显着增加，推测LIN28/let-7/bcl-xL通路参与肿瘤细胞的耐药过程。

3 小 结

研究已经表明，具有LIN 28高表达的恶性肿瘤患者存活率降低。在恶性肿瘤中LIN28高表达和let-7的抑制可以用作临床实践中恶性肿瘤的诊断标记物。而降低细胞内LIN28蛋白含量，或增加let-7的水平可逆转这种恶性循环，促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长。另外，LIN28/let-7参与了恶性肿瘤相关的信号通路，使其成为癌症治疗的潜在靶点，可以作为克服患者目前各种治疗抵抗的新策略。