外泌体在卵巢癌化疗耐药中的研究进展

袁梦琴，王艳清，鲜舒，张莉，杨冬咏，刘诗意，程艳香

卵巢癌是一种高侵袭性肿瘤，是全世界妇科恶性肿瘤死亡的主要原因。卵巢癌患者手术减灭和化疗的最初临床反应通常较好，但约80%的晚期卵巢癌患者在12～24个月内发生肿瘤进展和复发，并且最终由于化疗耐药而导致死亡，5年总生存率仅约为30%[1]。因此，明确卵巢癌化疗耐药机制并进行靶向干预，有望成为攻克卵巢癌耐药这一难题的有效途径。

外泌体（exosomes）具有广泛的生物学效应，在很多生理病理过程中发挥重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤生长与迁移、组织损伤的修复等。外泌体可由多种不同类型的细胞分泌，包括免疫细胞、肥大细胞和多种肿瘤细胞等，且普遍存在于包括血清、腹水、脑脊液等在内的多种生物体液中[2]。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，因此可作为疾病诊断的生物标记物[3]。许多研究表明，外泌体与多种癌症中肿瘤细胞与肿瘤微环境中的细胞间耐药性的传递过程密切相关，其中也包括卵巢癌[4]。现对外泌体的生理、病理学效应及其在卵巢癌细胞化疗耐药方面的研究进展进行综述。

1 外泌体的合成与组成

外泌体最初于1983年从绵羊网织红细胞中鉴定出来，研究发现，真核生物细胞质膜内陷形成小的管状内体，并逐渐发育球形晚期内体，其特征是形成腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILV）。ILV通过局部膜内陷芽生，随机吞噬部分胞质内容物并将跨膜蛋白和外周蛋白结合到内陷膜中，转变为具有动态亚细胞结构的多囊泡体（multi-vesicle bodys，MVBs），随后当MVBs与细胞膜融合，其内的囊泡再次凹陷，以内出芽方式形成颗粒状小囊泡，并释放入细胞外环境，即外泌体[5]。

外泌体含有许多不同的细胞表面分子，能够同时与许多不同的细胞受体结合，从而参与细胞之间的物质交换。现有研究表明，外泌体内成分非常复杂，有多种核酸[微小RNA（microRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）等]、蛋白、胆固醇等组成。外泌体内含蛋白包括促膜融合的胞质蛋白Rabs家族及膜联蛋白（膜联蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅺ），跨膜蛋白（CD63、CD81和CD9），分子伴侣热休克蛋白（HSP60、HSP70和HSP90）以及一些细胞特异性蛋白，如MHC-Ⅱ（抗原提呈细胞来源）等[6]。近年来，随着研究的逐渐深入，现已证实除蛋白质外，外泌体还携带多种核酸类物质，如微小RNA（miRNA，包括miR-373、miR-200等）、lncRNA（包括FMR1-AS1、HISLA等）以及少量的circRNA（如circ-0044520）等，并通过此途径参与细胞间物质的传递[7]。

2 外泌体的生理学效应

近年来研究发现，外泌体携带有多种生物活性物质，细胞可以通过分泌外泌体与邻近或远距离细胞膜融合，介导生物活性物质由供体细胞向受体细胞的转运，进而在调节细胞生理活动，维持细胞内稳态及在细胞间信息、物质交流等方面发挥着重要的作用[8]。根据细胞和组织的来源不同，外泌体有着不同的生物学效应，如来源自内皮干细胞的外泌体中的miR-126和miR-296可促进胰岛血管内皮细胞中的血管生成，该过程对于移植的胰岛植入和存活至关重要。此外，外泌体还具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫调节作用[9]。

3 外泌体与肿瘤

肿瘤微环境主要由成纤维细胞、内皮细胞和淋巴细胞浸润组成，可促进肿瘤进展，已有证据显示肿瘤微环境可通过分泌蛋白质等生物活性物质促进正常细胞发生癌变及肿瘤进展。近年来多项研究表明，除经典途径外，肿瘤微环境中的循环外泌体和靶细胞表达的跨膜分子之间的表面相互作用也可启动细胞间通讯。还有研究表明癌细胞比正常细胞分泌更多的外泌体，提示外泌体与肿瘤有着明显相关性[10]。这些促进肿瘤发生、发展的外泌体既可来自非肿瘤细胞，也可来自肿瘤细胞，如侵袭性乳腺癌细胞可通过增加基质细胞外泌体中的末端暴露的RN7SL1的含量，从而促进肿瘤生长及耐药发生[11]。肿瘤来源的外泌体以自分泌或旁分泌等信号途径影响其微环境，从而促进肿瘤新生血管形成、骨髓环境和肿瘤基质重塑、促进肿瘤侵袭和转移、逃避机体免疫机制、产生化学抗性等[12]。如黑色素瘤[13]、膀胱癌[14]衍生的外泌体在肿瘤微环境中促进上皮-间质转化（EMT），从而促进癌细胞的转移和发展，还有研究表明肿瘤外泌体可分泌抑制自然杀伤细胞活性并诱导T细胞凋亡的因子，为肿瘤自身创造了良好的生长环境。

4 外泌体在卵巢癌化疗耐药方面的作用机制

卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一，由于卵巢位于盆腔深部，早期病变不易发现，晚期病变也缺乏有效的治疗手段，因此卵巢癌致死率居妇科恶性肿瘤首位。目前卵巢癌主要的治疗方法为肿瘤细胞减灭术和手术后辅助紫杉醇联合铂类化疗，初始反应一般较好，然而，由耐药性导致的复发和转移十分常见[15]。大量研究发现，外泌体对于卵巢癌的化疗耐药性的发生可能起着非常重要的调节作用。

4.1 卵巢癌细胞通过外泌体增加化疗药物的排出介导化疗耐药 Safaei等[16]的研究发现顺铂（CDDP）耐药的卵巢癌细胞释放出的外泌体中顺铂含量是CDDP敏感的卵巢癌细胞的2.6倍。卵巢癌细胞通过释放出更多的外泌体来增加顺铂的排放，同时外泌体中转运蛋白的增多也与耐药产生有关。前期研究表明，正常情况下CDDP在溶酶体中浓缩，而CDDP抗性的肿瘤的溶酶体室明显缩小，约为敏感细胞中的溶酶体区室的40%，并且外泌体释放更多的CDDP输出转运蛋白，包括MRP2、ATP7A、ATP7B和溶酶体相关蛋白1（LAMP1）。近年来也有研究表明携带P-糖蛋白（P-gp）的外泌体与卵巢癌紫杉醇及阿霉素耐药性有关。P-gp的作用是从细胞中外排化疗药物，维持化疗药物在细胞内的低浓度水平，其升高意味着对化疗产生耐药性。Zhang等[17]研究发现在膜结合蛋白水平，P-gp通过外泌体的细胞间转移途径在人卵巢癌细胞之间实现“共享”。通过比较野生型亲本系（A2780/WT）与紫杉醇耐药卵巢癌细胞（A2780/PTX）发现，耐药细胞产生并释放更多的外泌体，且A2780/PTX细胞分泌的外泌体携带大量P-gp，而A2780/WT细胞中几乎检测不到P-gp。由于高水平的P-gp表达，阿霉素不能进入A2780/PTX细胞的细胞核而产生耐药。此外，将卵巢癌耐药细胞来源的外泌体与其亲本系共孵育后，发现敏感细胞对阿霉素和紫杉醇的抗性均较未孵育前高出5倍。这提示外泌体中的P-gp促进卵巢癌细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药性。也有研究表明外泌体中的肺耐药相关蛋白（LRP）也可通过加速药物排出细胞[18]，以及增加DNA甲基转移酶1（DNMT1）的表达[19]，介导卵巢癌化疗耐药发生。

4.2 膜联蛋白A3（Annexin A3）的分泌增加可介导卵巢癌化疗耐药性的产生 Yan等[20]通过蛋白质组学分析发现Annexin A3（一种Ca2+和磷脂结合膜联蛋白家族）的表达在铂耐药卵巢细胞系中显著增加，且可能是通过阻止细胞中铂的摄取或积累来介导卵巢癌耐药。Yin等[21]的研究也表明，与亲本细胞系A2780和SKOV3相比，铂类耐药卵巢癌细胞系A2780/Cis和SKOV3/Cis表达更高水平的Annexin A3，且Annexin A3高表达的卵巢癌细胞在其细胞质中具有更多的囊泡，其中一些囊泡是Annexin A3+，提示Annexin A3的分泌可能与含有Annexin A3的囊泡的胞吐作用和外泌体的释放有关。通过将20例铂耐药患者、30例铂敏感患者与正常女性的血清进行对比发现，铂类耐药卵巢癌患者的Annexin A3水平显著升高。这些研究均提示，Annexin A3的增加可能与外泌体介导耐药相关，可能成为卵巢癌及顺铂耐药的潜在生物学标志物。

4.3 外泌体通过诱导SMAD同源物4（SMAD4）突变诱导EMT来介导卵巢癌化疗耐药 SMAD是转化生长因子β（TGF-β）信号通路的效应转录因子，而SMAD4主要与受体激活的SMAD（SMAD2或SMAD3）结合，形成异二聚体，易位进入细胞核后，在核内与其他辅因子结合并启动靶基因的转录[22]。Crow等[1]通过使用不同铂类耐药程度的卵巢癌细胞系来研究外泌体对耐药性的影响，发现敏感细胞系A2780细胞经高度耐药细胞C30和CP70分泌的外泌体预处理后，其细胞活力分别增加近1.5倍和2倍，同时细胞凋亡减少。当用卡铂耐药的OVCAR10细胞分泌的外泌体处理A2780细胞时，也观察到类似的结果。对卵巢癌细胞系进行DNA测序结果显示，在高度铂耐药细胞系（C30、CP70和OVCAR10）中均存在SMAD4的体细胞突变。进一步研究发现，铂耐药细胞系中EMT标志物显著上调，EMT标志物已被确立为卵巢癌耐药性的重要介质。此外，用铂耐药细胞系衍生的外泌体处理敏感的A2780细胞后，EMT标志物也会显著上调。综上，铂耐药的卵巢癌细胞可通过衍生的外泌体导致铂类敏感的卵巢癌细胞发生SMAD4突变，进而导致铂类药物敏感性降低。

4.4 miRNA通过外泌体转移到邻近基质细胞介导卵巢癌紫杉醇耐药及恶性表型 Au Yeung等[23]发现miR-21可通过外泌体从基质成纤维细胞转移到受体卵巢癌细胞系SKOV3ip，并且转移的miR-21的量取决于外泌体中递送的miR-21的量。该研究用从miR-21+MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）及miR-21-MEFs分离出的同等量的外泌体处理2种卵巢癌细胞OVCA432和SKOV3，给予紫杉醇治疗后显示miR21+MEFs外泌体处理的细胞中残留的细胞数量更高。将转染miR-21的CAAs和CAFs来源的外泌体与SKOV3细胞共孵育后发现，凋亡酶激活因子1（APAF1）mRNA水平显著降低，进一步实验验证了基质细胞通过外泌体将miR-21递送至卵巢癌细胞，并激活APAF1来增加卵巢癌细胞的侵袭性及介导卵巢癌细胞紫杉醇耐药。同时，另有研究也表明多个miRNA对卵巢癌耐药起着重要的介导作用，如Pink等[24]研究发现miR-21-3p可能在卵巢癌细胞中通过靶向NAV3来诱导顺铂耐药。

5 结语

综上所述，外泌体具有广泛的生物学效应，对机体的生理病理都起重要的调控作用。卵巢癌源性的外泌体对于卵巢癌的早期诊断、耐药形成及治疗等方面的研究有着重要的临床意义。目前研究发现外泌体对于卵巢癌化疗耐药的调节作用可能是一个重大的突破点，有望成为卵巢癌化疗疗效评估的潜在生物学标志物及治疗新靶点。然而目前外泌体的研究仍面临一些困境，比如外泌体的分离提纯等。随着外泌体相关研究不断深入，外泌体在卵巢癌化疗耐药方面的临床应用将为铂类耐药的卵巢癌的治疗提供新的方法。