长链非编码RNA与子宫内膜异位症关系的研究进展

崔粮驿，王丹丹，陈思蕾，杨清

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种以子宫内膜基质和腺体出现在宫腔以外部位为特征的妇科疾病[1]。EMs的发病机制是多因素的，激素、免疫、环境及遗传因素等都与其相关，尽管确切的发病机制仍不明确，但遗传因素发挥了重要作用，尤其是表观遗传学因素[2-3]。

人类基因组中，约98%为非蛋白编码序列，其转录产物组成了庞大复杂的非编码RNA（ncRNAs），既往学者们把这些转录产物解释为无意义的转录碎片，但近年来学者们认识到这些ncRNAs可以参与人类的很多病理生理学过程。根据ncRNAs的长度，可以将其分为短链ncRNAs和长链ncRNAs（lncRNAs）。短链ncRNA长度约22个核苷酸，如微小RNA（miRNAs）[4]，而lncRNAs含有超过200个核苷酸。根据与蛋白编码基因的相对位置关系，lncRNAs可以分为5类：①正义lncRNAs，即与编码基因的1个或多个外显子重叠；②反义lncRNAs，转录方向与相邻基因转录方向相反，至少有1个外显子与基因重叠；③双向lncRNAs，与蛋白编码基因启动子相同，但转录方向相反；④内含子lncRNAs，由基因的内含子产生；⑤基因间lncRNAs，由位于蛋白编码基因之间的序列转录而来[5]。lncRNAs能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达，并参与了X染色体基因沉默、基因组印迹及染色质修饰等重要调控过程，在多种肿瘤的发展过程中发挥促癌或抑癌功能。而近年越来越多的研究发现，lncRNA与EMs的发生、发展也密切相关。

1 多种lncRNAs在EMs组织中存在差异表达

2014年，Sun等[6]利用基因芯片技术对比了4例EMs患者的异位内膜组织及配对的在位内膜组织中lncRNAs和mRNA的表达水平，结果发现有948个lncRNAs存在着差异表达 [差异倍数（fold change，FC）＞2，P＜0.05]，其中527个lncRNAs上调，421个下调。该研究还通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术在其余21例EMs患者的标本中验证了此芯片结果，其中上调最显著的是CHL1-AS2（FC=135.3），下调最显著的是LOC100505776（FC=363.7）。2015年，Wang等[7]通过基因芯片技术对比了3例EMs患者的在位内膜组织及3例正常内膜组织中lncRNAs的表达差异，结果发现有1 277个lncRNAs存在差异表达（FC＞2，P＜0.05），其中488个lncRNAs上调，789个下调。上调最显著的是AC068282.3（FC=31.3），下调最显著的是RP11-403H13.3（FC=44.3），芯片结果也经过qRT-PCR验证。该课题组进一步分析发现，AC002454.1可以通过细胞周期依赖性蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）调节细胞周期促进内膜细胞的转移及侵袭，进而参与EMs的发病过程[8]。2018年Cui等[9]通过对5例EMs患者的在位内膜组织及5例正常内膜组织进行RNA测序发现，有88个lncRNAs存在差异表达，其中33个上调，55个下调。其中上调最显著的是SNORD3A（FC=3.0），下调最显著的是ABO（FC=2.0）。

2 EMs与全基因组关联分析（genome-wide association studies，GWAS）

GWAS是通过全基因组测序的手段发现在某一特定人群中遗传突变与表型（疾病）之间的相关性[10]。目前，有关EMs的GWAS已经发现了许多与EMs发病风险相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点，这些SNP大多数位于基因的非编码序列，尤其是编码lncRNAs的序列[11]。其中最值得注意的是位于9号染色体上的SNP rs10965235，该SNP位于细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂2B反义RNA（CDKN2B-AS）基因的内含子6中，编码lncRNA CDKN2B-AS。目前的研究发现，SNP rs10965235与日本人[12]（P=5.57×10-12，OR=1.44）、高加索人[13]（P=1.25×10-2，OR=1.32）及韩国人[14]（P=1.30×10-4，OR=1.49）的EMs发病风险相关。王彦袖[15]关于中国人的GWAS发现，SNPrs10965235也是中国北方妇女EMs发病的潜在危险因素。但有关CDKN2B-AS在EMs发病和发展过程中的具体作用机制还有待于进一步研究。

3 lncRNAs与EMs的上皮间充质转化（epithelialto-mesenchymal transition,EMT）

EMT是指上皮细胞获得间充质细胞表型的过程。在EMT过程中，上皮细胞失去了细胞极性及与基底膜的连接，上皮性标志物如钙黏蛋白E（E-cadherin）及角蛋白（Keratin）表达量减少，间充质标志物如钙黏蛋白N（N-cadherin）及波形蛋白（Vimentin）表达量增加，EMT被认为是上皮性恶性肿瘤发展的重要过程，也与EMs的发生、发展密切相关。肺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）属于lncRNAs，其位于染色体11q13.1，最早在非小细胞肺癌中被发现，与多种疾病的发生、发展密切相关[16-18]。而最近有研究发现，MALAT1在异位内膜组织中的表达上调。Liang等[19]的研究发现miR-200C可以抑制EMs的EMT过程，而MALAT1作为miR-200C的竞争性内源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），可以通过上调EMT相关的转录因子ZEB1和ZEB2来促进EMT过程，而Du等[20]则发现雌激素可以促进这一过程。除此之外，MALAT1还可以介导子宫内膜间质细胞（endometrial stromal cells，ESCs）在缺氧诱导下的细胞自噬[21]，而缺氧也被认为是EMs发病的重要促进因素。Lin等[22]发现lncRNA AFAP1-AS1在EMs组织中显著上调，敲减AFAP1-AS1可以抑制转录因子ZEB1的启动子位点pGL3-P886的活性，并可以抑制子宫内膜上皮细胞的生长，表明该作用机制可能与EMT过程相关。Mai等[23]发现沉默LINC01541可以通过促进EMT过程而增强ESCs的侵袭能力，而过表达LINC01541可以抑制ESCs中血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表达并诱导细胞凋亡。

4 lncRNAs调控EMs细胞的生物学行为

由于EMs具有类似恶性肿瘤的侵袭、黏附等特征，因此研究lncRNAs对EMs细胞生物学行为的影响是学者们关注的重点。Sha等[24]的研究发现，LINC00261在异位内膜组织中的表达显著下调，在EMs细胞系CRL-7566中过表达LINC00261后，细胞的增殖和迁移能力均出现明显下降，表明LINC00261对EMs的发生、发展起到抑制作用，但具体调控机制还不明确。Liu等[25]通过生物信息学方法分析了3个EMs的数据集后发现，LINC01279在EMs组织中表达显著上调，并与细胞周期蛋白依赖性激酶14（cyclindependent kina se 14，C DK14）的表达相关，因此推测LINC01279可能参与了EMs的细胞周期调控。Zhang等[26]通过基因芯片发现lncRNA CCDC144NL-AS1在EMs患者的异位内膜组织和配对的在位内膜组织中存在着差异表达。在hEM15A（人EMs患者在位内膜间质细胞系）中敲减CCDC144NL-AS1后，细胞的迁移和侵袭能力得到了抑制，但对细胞的增殖、黏附、凋亡及细胞周期没有影响。进一步分析发现敲除CCDC144NL-AS1后hEM15A细胞的肌动蛋白骨架形态发生了明显变化，同时影响了纤维型肌动蛋白（Fibrous actin，F-actin）在细胞内的分布，提示CCDC144NL-AS1对hEM15A细胞迁移和侵袭能力的影响可能与细胞骨架有关。另外，Zhang等[27]还对芯片中筛出的差异mRNA及lncRNAs进行了生物学信息分析，结果发现mRNA细胞黏附相关分子L1样（cell adhesion molecule L1 like，CHL1）及其对应的2个反义lncRNAs——CHL1-AS1及CHL1-AS2存在明显的表达相关性，据此推测其可能参与EMs的发生、发展，这与Sun等[6]的测序结果是一致的。

5 lncRNAs与EMs相关性不孕

不孕是EMs患者常见的临床表现之一，有报道称25%～50%患有不孕症的女性同时也患有EMs，而30%～50%的EMs患者表现为不孕[28]。Ghazal等[29]发现EMs患者的在位内膜中lncRNA H19表达显著降低，而降低的H19通过ceRNA机制增加了miRNA let-7的活性，反过来在转录后水平抑制了胰岛素样生长因子1受 体 （insulin-like growth factors 1 receptor，IGF1R）的表达，从而抑制了ESCs的增殖，据此该研究认为EMs患者中H19/Let-7/IGF1R轴的改变可能是导致不孕的机制之一。此外，有研究发现EMs患者中下调的MALAT1可以通过激活细胞外信号调节激酶/丝裂素活化蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase/mitogen active protein kinase，ERK/MAPK）信号通路来抑制卵泡颗粒细胞的增殖[30]，而上调的lncRNAENST00000433673会影响胚胎的植入[31]。但一项关于腹膜型EMs的研究发现，lncRNA的差异表达并不会影响不孕患者子宫内膜的容受性[32]。

6 lncRNAs可能成为诊断EMs的分子标志物

除了超声可以发现卵巢EMs的囊肿之外，腹腔镜探查术为诊断EMs的金标准，这导致EMs的确诊通常要推迟5～10年之久。因此找到与EMs相关的非侵入性分子标志物一直是学者们研究的热点，尤其是对于那些超声下无法诊断的患者[33-34]。Wang等[35]分析了110个血清样本和24个组织样本中的lncRNAs差异表达谱，并利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）评估其诊断价值，结果发现EMs患者血清中的lncRNA ENST00000482343可以作为潜在的分子标志物，ROC曲线下面积（area under the ROCcurve，AUC）为0.716（95%CI：0.618～0.814，P＜0.001），敏感度为0.724，特异度为0.717。同时该研究还发现联合5个特定lncRNAs得到的诊断价值更高，AUC可达0.880（95%CI：0.811～0.948，P＜0.001），敏感度为0.817，特异度为0.732。Qiu等[36]发现EMs患者血清中外泌体lncRNA aHIFs明显上调，并具有促进EMs血管生成的作用，因此认为外泌体lncRNA aHIFs也可能成为诊断EMs的分子标志物。

7 结语与展望

作为体内ncRNAs家族的重要成员，lncRNAs在多种疾病的发生、发展过程中发挥着重要的调节功能。近年来，随着高通量测序技术的发展，lncRNAs的重要功能备受重视。EMs作为一种育龄期妇女常见的疾病，严重影响其生理健康，该病发病原因虽不明确，但遗传因素在其中起到了重要作用。虽然学者们已经发现了多种差异表达的lncRNAs，可能在EMs的发生、发展过程中发挥重要作用，但具体的作用机制尚待进一步阐明。同时，若能进一步筛选出特异度和敏感度均较高的lncRNAs，将极大程度地推进EMs的早期诊断。