DNA及RNA甲基化检测在肿瘤诊断中的研究进展

赵 琦，相绿竹，彭 瑞，王 晔 综述,牟晓峰△ 审校

(1.青岛大学医学部，山东青岛 266021；2.青岛市中心医院检验科，山东青岛 266042)

基因甲基化是表观遗传学中的一个重要组成部分，是在不改变基因组核苷酸序列的情况下，将有活性的甲基化合物在相关转移酶的催化下结合到其他化合物上的过程。目前已发现的基因甲基化形式主要有DNA甲基化、RNA甲基化以及组蛋白甲基化，在多种生物学过程中发挥着重要的作用，包括基因的表达、干细胞的自我更新和分化、组织发育、RNA的稳定性等等。本文将从基因甲基化的概念、在肿瘤中的作用机制、检测方法等方面做一综述，为后续研究提供理论基础。

1 甲基化的概念

1.1DNA甲基化 DNA甲基化是DNA甲基转移酶(DNMT)介导的一种化学修饰过程，在DNMT催化下，通过S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基，将甲基转移到相应碱基上。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG岛5′端胞嘧啶上，生成为5′甲基胞嘧啶[1]。CpG岛为富含G、C碱基的DNA区域，主要位于基因的启动子。人类的CpG以2种形式存在，一种分散于DNA中，另一种是CpG结构高度聚集的CpG岛。在正常组织中，前者多被甲基化修饰，而后者常以非甲基化状态存在于启动子区[2]，大约有60%的人类基因存在于启动子区的CpG岛。在高等真核生物中已发现的DNMTs有：DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L[3]。DNMT1是一种维持甲基化的甲基化转移酶，它能识别DNA复制时生成的“半甲基化DNA”，即其亲代链已经甲基化，进一步促进子链形成新的甲基化CpG二核苷酸；DNMT3a和DNMT3b则主要在胚胎形成时期促进新的甲基化形成[4]。

1.2RNA甲基化 RNA甲基化一般是指m6A基因的甲基化。即碱基A第6位N原子上增加一个甲基。m6A主要存在于mRNA的CDS区(蛋白质编码区)和3′UTR区，影响信使RNA(mRNA)的稳定性、翻译效率、可变剪接和定位等，在后转录层面参与真核基因的表达调控[2]。

RNA甲基化在体内受到3种效应蛋白的调控，“书写器”、“消除器”和“阅读器”[2]。“书写器”是指m6A甲基化转移酶，介导RNA的甲基化修饰过程，主要指METTL3-METTL14复合物[5-6]，两者可在体外和体内催化mRNA(和其他细胞核RNA)的m6A甲基化；另一种常见转移酶是肾母细胞瘤1结合蛋白(WTAP)[7]；“消除器”是指去甲基化酶，介导RNA的去甲基化修饰过程，主要包括FTO[8]和ALKBH5[9]。“阅读器”主要包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3[10]，可识别RNA甲基化修饰的信息，并参与下游RNA的翻译、降解等过程。比如，YTHDC1可与mRNA上的m6A结合，将mRNA转运出核。YTHDF1/YTHDF3识别m6A后可促进mRNA的翻译，而YTHDF2与m6A的结合则会促进mRNA的降解。

2 甲基化与肿瘤

2.1异常DNA甲基化与肿瘤发生的关系 在肿瘤细胞中，常常有正常DNA甲基化模式异常改变，常表现为全基因组广泛低甲基化及抑癌基因CpG岛区域高甲基化；除此之外，基因错配修复系统的失活、微小RNA(miRNA)表达缺失等均和DNA甲基化有着千丝万缕的联系。

2.1.1抑癌基因CpG岛区域高甲基化 正常情况下，抑癌基因的CpG岛为非甲基化状态；而在某些肿瘤中抑癌基因启动子区CpG岛区域发生高甲基化，抑制了其转录和表达，使抑癌基因失活，导致肿瘤的产生。吴亮等[11]发现抑癌基因DACH1启动子甲基化程度与食管鳞癌分化程度成反比，提示DACH1启动子甲基化有很大可能促进食管癌的发生、发展。

2.1.2癌基因组的广泛低甲基化 肿瘤细胞中常见全基因组的低甲基化会导致基因的突变率增加，特异基因尤其是启动子区域的低甲基化则会激活癌基因，促进肿瘤生长及转移[12]。

2.1.3基因错配修复与DNA甲基化 DNA错配修复系统(MMR)能够修复几乎所有碱基的错配，最大程度避免基因突变。而有研究发现，当MMR缺陷时，CpG岛会出现较强的甲基化[13]，碱基错配将不能被修复，因此造成的基因突变也是肿瘤发生的机制之一。

2.1.4CpG甲基化促进肿瘤相关基因突变 研究证明，甲基化的CpG岛基因突变的频率远高于正常水平。比如在结肠癌患者的p53基因中，55%左右的突变发生在CpG位点上，其中94%是C→T的突变，甲基化的CpG突变为TpG，经过DNA复制，最终从C∶G转换为T∶A，导致遗传信息的改变，最终可导致肿瘤的发生[14]。

2.1.5DNMT与肿瘤 作为DNA甲基化的催化酶，DNMT基因在异常甲基化中起着不可替代的作用。肿瘤细胞中某些部位基因的高甲基化往往预示着DNMT表达的增加，相反，DNMT表达的异常增加也可能导致部分基因尤其是抑癌基因的异常高甲基化，进一步促进肿瘤的产生。RAJNEESH等[15]发现，与乳腺干细胞相比，DNMT1在肿瘤干细胞中表达增加，而DNMT1基因的功能缺失则通过阻断肿瘤干细胞的形成来保护小鼠免受乳腺肿瘤的影响。方钦亮等[16]采用免疫组织学技术检测了89例手术切除肝癌组织与癌旁组织中DNMT1和DNMT3b的表达情况，发现肝癌组织中DNMT1和DNMT3b普遍存在过表达，且显著高于癌旁组织，提示了这2种甲基化转移酶与肝癌的发生和进展可能存在密切的关系。KIM等[17]对102例非小细胞肺癌进行研究，结果发现DNMT1和DNMT3b mRNA表达提高，同时检出相关抑癌基因高甲基化。

2.1.6微小RNA(miRNA)编码DNA甲基化与肿瘤 miRNA通过降解目标mRNA或抑制其翻译从而实现对细胞生物学功能的调节。某些miRNA在癌旁组织和肿瘤组织中出现表达差异[18]，表现为表达增加或表达下降，罗顺容等[19]采用实时荧光定量PCR法对27份非小细胞肺癌(NSCLC)组织及其癌旁正常组织标本的miRNA-205进行相对定量分析，发现肺鳞癌的miRNA-205表达水平升高，这可能与其编码基因启动子低甲基化有关；某些具有抑癌基因功能的miRNA的编码基因启动子区在癌症中呈现出高甲基化状态，而使其表达受到抑制[20]。

2.2RNA甲基化与肿瘤 近年来很多研究表明RNA甲基化与肿瘤的发生、发展密不可分，包括“书写器”、“消除器”及“阅读器”的异常都可导致肿瘤的产生与进展。有研究表明，包括METTL-3和METTL14复合体、RNA结合蛋白15等甲基化转移酶复合物在髓系白血病中高度表达，它们的改变往往预示着预后不良，如m6A水平的升高可能预示着髓系白血病的发生[21]。除此之外，METTL-3和METTL14复合体还可影响某些信号因子活性来发挥其对肿瘤细胞的作用。研究表明mRNA甲基化可以通过调节蛋白激酶B(AKT)的活性促进子宫内膜癌细胞的增殖和致癌性，其机制之一就是METTL14热点R298P的突变和METTL-3表达减少，导致AKT负调节器PHLPP2表达降低以及正向调节器mTORC2表达增高，导致AKT表达增加，而AKT又可促进细胞的存活和生长，进一步证实mRNA甲基化的降低可以增加子宫内膜癌细胞的增殖和致癌性[22]。

去甲基化酶的表达也与肿瘤关系密切，例如：低氧促进乳腺癌的表达，部分是通过增加去甲基化酶ALKBH5的表达，进而减少m6A表达水平来实现的[23]；有研究者也发现，在某些急性粒细胞白血病亚型中出现FTO的高表达，具体机制为：FTO基因促进细胞增殖或转化和体外抑制细胞凋亡，而某些白血病相关致癌基因会使FTO的表达水平上调；使用MeRIP-seq测序法证实FTO过表达和敲除会分别降低和提升靶基因ASB2和RARA的m6A水平，进一步证实FTO可促进AML的发展，在AML中发挥着“原癌基因”的作用[24]。除此之外，免疫组化分析表明阅读器YTHDF1表达与多种恶性肿瘤的行为有关，如肿瘤侵犯深度、淋巴结转移、恶性肿瘤的分期，NISHIZAWA等[25]对结直肠癌患者生存期的研究表明，高YTHDF1表达的患者有显著较差的总生存期，YTHDF1表达是影响患者预后的独立危险因素，体外研究表明，敲除YTHDF1基因后，使用抗癌药物氟尿嘧啶和奥沙利铂等可抑制肿瘤的生长。

3 分子甲基化的检测

3.1DNA甲基化的检测 检测基因组DNA甲基化水平的方法有很多，总体分为2大类：一类是检测基因组总体甲基化水平，包括变性高效液相色谱法、基于抗5mC的免疫化学法、SssI甲基转移酶法等，另一类方法则可检测到具体的甲基化位点，例如甲基化敏感限制性内切酶-Southern印记杂交技术、重亚硫酸氢钠修饰后测序法、甲基化特异性PCR、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法等。

3.1.1变性高液相色谱法(DHPLC) DHPLC技术可对DNA甲基化进行定量检测，由于异源双链DNA和同源双链DNA被色谱柱保留的时间不同，导致了DNA片段的洗脱特性差异。DNA片段的保留时间由DNA序列的G/C含量和存在的DNA失配来确定。序列中CpG位点的甲基化导致PCR产物的G/C含量比未甲基化基因组的含量增加，导致更高的熔融温度，进一步增加了保留时间。在部分变性条件下，通过监测由硫酸氢盐处理的DNA扩增子保留时间，可以揭示DNA甲基化的差异[26]。

3.1.2基于抗5mC抗体免疫化学法 利用5mC抗体能够与5mC发生特异性反应：应用荧光素标记该抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行测量即可得到5mC的水平，荧光素强度与5mC水平成正比。抗体的设计决定了该方法的灵敏度和特异度。

3.1.3CpG甲基转移酶(M.SssI)法 CpG甲基转移酶(M.SssI)能识别双链DNA上的CpG二核苷酸序列，并甲基化其中的胞嘧啶残基。由3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)提供甲基，在M.SssI甲基转移酶催化下转移到基因组DNA的CpG胞嘧啶使其发生甲基化[27]。剩余腺苷甲硫氨酸(SAM)放射性强度与所测DNA甲基化水平成反比。但因M.SssI甲基转移酶不稳定，导致结果不够精确，可以用设置M.SssI甲基转移酶自身对照组这一办法解决。

3.1.4甲基化敏感的限制性内切酶-Southern印记杂交技术 甲基化敏感限制性内切酶只切割非甲基化DNA片段；而甲基化不敏感的限制性内切酶无论DNA片段是否甲基化都会切割。根据这一特性，将DNA分别用两种内切酶切割，用放射性标记32P的探针对目的片段作Southern杂交。比较两组条带的差异即可得到目的位点的甲基化状态。该法简便、快捷，可定位具体甲基化位点。

3.1.5重亚硫酸氢钠修饰后测序法[28]待测DNA片段中非甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐修饰后，转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，进一步通过高通量测序比较就可间接判断样品中的胞嘧啶甲基化与否。该方法分辨率高，可检测出DNA序列上的全部甲基化信息，但费用较高。

3.1.6甲基化特异性PCR(MSP) 首先将DNA经亚硫酸氢钠处理，其次进行PCR反应，针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化或非甲基化DNA链设计出两种引物对，若用前者能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；若用后者能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。王春华[29]通过实时荧光定量PCR法(RT-PCR)和测序法检测支气管肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化情况，发现RT-PCR与测序法检测SHOX2和RASSF1A甲基化的一致率达到了99%和100%。该法具有较高的特异度、灵敏度，但待测序列需已知，引物设计不足或亚硫酸氢钠对DNA处理不完全易致假阳性。

3.1.7重亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)[30]将亚硫酸氢钠处理后的DNA进行PCR扩增，用限制性内切酶酶切PCR产物，后根据电泳条带的不同位置及亮度即可检测出DNA 的甲基化状态及甲基化程度。JACOB等[31]应用COBRA与测序相结合(COBRA-Seq)检测出在卵巢癌中GBGT1基因启动子区出现高甲基化。该法简便、可定量，避免了由甲基化敏感性酶产生的假阳性，但检测位点受限，不能除外假阴性检测的可能性。

3.1.8PCR荧光法 早在2000年，EADS等[32]就报道了采用荧光实时PCR的定量检测DNA甲基化的技术，该方法基于Taqman®探针实时定量检测。其中探针的设计是关键。首先由重亚硫酸盐联合限制性内切酶分析法检测DNA甲基化状态，其次设计与待测甲基化DNA位点互补的探针，探针的5′端连接上一个荧光报告寡核苷酸基团(6FAM)，3′端连接荧光淬灭寡核苷酸基团(TAMRA)，当探针与待测DNA杂交时，在PCR引物延伸至探针时，TaqDNA 聚合酶5′至3′外切酶活性会将探针5′端的荧光报告基团切下，3′荧光猝灭基团则不能再将其抑制，荧光报告基团释放荧光即可被检测，荧光强度和甲基化水平成正比。但该方法前提是待测DNA序列已知。

3.2RNA甲基化检测方法 同DNA甲基化检测方法相类似，RNA甲基化检测同样分为整体水平和精确到特异位点的检测方法。整体甲基化检测方法主要有LC-MS/MS(液相二级质谱法)；而MeRIP-seq、miCLIP以及SCARLET等方法则可明确甲基化位点，稍有不同的是MeRIP-seq法分辨率较低，为100碱基左右，而miCLIP和SCARLET法可精确到单碱基的程度。

3.2.1LC-MS/MS 在液相质谱的基础上采用串联质谱，能够获得分子离子峰和碎片离子峰，可对碱基同时进行定性和定量分析。将消化为单碱基的RNA样本注入液相色谱仪，根据出峰的保留时间面积可计算各个碱基的含量；而后进入质谱串联分析，将单个核糖核苷酸打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤，根据出峰的保留时间计算m6A的面积。最后根据m6A和总腺嘌呤的比例计算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。该方法可定量，且简便、成本低，但不能对甲基化位点准确定位。

3.2.2MeRIP-seq/m6A-seq 该方法结合了免疫共沉淀和高通量测序的方法，用m6A特异性抗体筛选带有m6A的mRNA片段并将其沉淀，构建相应的cDNA测序文库，后进行高通量测序，对m6A甲基化程度较高的区域进行定位。该法可以以较高的精确度对全基因组进行测序，并得到较为精确的甲基化位点[33]。由于该方法的分辨率为100碱基左右，所以只能对大致的区域进行分析。

3.2.3miCLIP miCLIP是一种结合免疫共沉淀、共价交联及高通量测序的技术[34]，它的基本检测原理为：用紫外光诱导m6A抗体与含有m6A的RNA交联，交联后该RNA反转录得到的cDNA会出现C-T突变或者就此截断，因此可以指示m6A的存在。

3.2.4SCARLET SCARLET法是一种结合了特定位点切割、放射性标记、“夹板”辅助提取以及薄层色谱法等多种技术的RNA测序法[35]。首先根据靶mRNA序列设计嵌合寡核苷酸，对目标核苷酸进行放射性标记；其次利用“夹板”辅助将嵌合寡核苷酸同待测RNA“结扎”在一起，后用RNA酶消化，待测序列因受“夹板”固定保护免受酶解，从而可被检测。最后利用薄层色谱法分析具体修饰位点。该法分辨率高，但由于有放射性以及成本较高，使其开展受限。

4 展 望

DNA及RNA的甲基化修饰在肿瘤发生、发展中的重要作用已被大量专家学者研究所证实，其中DNA甲基化调控肿瘤的机制研究在近十几年已日趋完善，某些研究较为成熟的基因已有商品化试剂盒流通，各种DNA甲基化抑制药物推陈出新，为癌症患者带来了福音。相比之下，近几年火热的以m6A修饰为主的mRNA甲基化对肿瘤的调控机制研究还处于初期阶段，因此各种mRNA m6A检测技术成为推动其发展的重要手段，也为癌症患者的早诊、早治提供了新的方法。本文简要介绍了两种表观遗传学修饰与肿瘤的相互作用，以及相关检测方法，希望能对甲基化领域初级研究者提供帮助。同时期待更方便、准确、快速以及经济的检测手段的出现，进一步提高检测的特异度和灵敏度，从而更好地服务于临床，推动表观遗传学在肿瘤早期诊断以及分期、预后和治疗中的发展，为肿瘤患者带来新的希望。