Toll样受体4在出血性脑卒中后脑损伤及其治疗中的作用研究进展

冯宇轩 姚声涛 匡舒蔓 余国清 向成明

[摘要] 出血性脑卒中是一种较为常见的急危重症，通常以脑实质内或脑底动脉环处血管破裂为主要的发病原因。近年来，国内外专家学者根据出血部位的差异将其分为多种类型，并通过研究分析后发现它们往往会由于继发性脑损伤的发生而严重影响患者预后。然而最近有研究发现Toll样受体4（TLR4）的信号转导通路广泛存在于脑出血后炎性反应、神经细胞凋亡以及脑血管痉挛和脑积水等继发性脑损伤之中，并且通过抑制TLR4信号通路能够减少脑损伤的发生率。因此，本文就目前TLR4在出血性脑卒中后脑损伤及其治疗中的作用研究进展进行综述。

[关键词] 出血性脑卒中;Toll样受体4;炎性反应;神经细胞凋亡;脑积水

[中图分类号] R743.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（c）-0022-06

[Abstract] Hemorrhagic stroke is a common acute and severe illness. The main cause of the disease usually refers to the rupture of vessels in the cerebral parenchyma or circle of willis. Recently， domestic and foreign experts and scholars divide it into many types according to the area of hemorrhage， and they find that the occurence of secondary brain damage will influence the patients prognosis through research and analysis. However， recent studies have found that Toll-like receptor 4 （TLR4） signal transduction pathways are widespread in post-cerebral hemorrhage inflammation， neuronal apoptosis， cerebral vasospasm and hydrocephalus， and we can reduce the incidence of brain injury by inhibiting TLR4 signaling pathways. Therefore， this article reviews the research progress on the effect of TLR4 on brain injury and its treatment after hemorrhagic stroke.

[Key words] Hemorrhagic stroke; Toll-like receptor 4; Inflammatory response; Neuron apoptosis; Hydrocephalus

脑卒中又称脑血管意外，是中枢神经系统中较为常见的疾病。临床上主要将其分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中。虽然出血性脑卒中在卒中患者中仅占据10%～15%，但是它具有极高的致死率和致残率[1]。然而，令人遗憾的是目前并没有临床证据证明任何一种药物治疗能够有效地提高患者的生存率和生活质量。因此寻找它的发病机制，并在疾病早期针对继发性脑损伤的发生进行预防变得至关重要。以前，关于脑出血后脑损伤的机制，通常认为其主要原因是颅内出血后血肿形成，进而压迫脑组织导致机械性损伤。近年来，通过大量的研究发现血细胞毒性、高代谢损伤、兴奋毒性损伤、氧化应激等都能够导致继发性脑损伤[2]。最近，研究人员在对Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）的研究中发现它们在出血性脑卒中后脑损伤的各条病理通路中都起到了至关重要的作用。而Toll样受体4作为其中一员在免疫识别、炎症调节等各個方面扮演重要的角色[3]。因此，本文就近年来出血性脑卒中后继发性脑损伤产生与TLR4之间相关性的研究进展进行综述。

1 TLR4简述

1.1 TLR4的历史

研究人员最早于1980年通过甄别同种果蝇胚胎发育过程中的不同发现了Toll基因。此后通过长期坚持不懈的探索，终于在1997年克隆出第1个人的Toll受体同源物，并在后来将其命名为TLR4。翌年，人类另外4种TLR被发现。与此同时，TLR4也被确认为脂多糖（LPS）的信号受体。自此，关于TLR4的研究不断深入。至今，已经在小鼠身上明确了13种哺乳动物的TLRs，并发现人类第11个TLR。

1.2 TLR4的结构和功能

1992年，西方学者首次提出模式识别受体这一概念，并认为非特异性免疫可通过模式识别受体识别多种病原微生物中高度保守的成分即病原体相关模式分子（pathogen associated molecular pattern，PAMP），从而产生免疫应答。目前的研究表明，TLR4属于膜型模式识别受体中表达于细胞膜上的一种跨膜蛋白，由膜外区、膜内区以及跨膜区三个部分组成。并分别在外周血细胞中的血小板、白细胞、巨噬细胞和中枢神经系统中的小胶质细胞、星形胶质细胞、脑血管内皮细胞、神经元等细胞中广泛分布[4-5]。而它主要是通过膜外识别PAMP，进而促进膜内的C端的Toll/IL-1受体结构域（Toll/IL-1R domain，TIR）介导信号传导通路的启动，从而引发一系列与免疫调控及炎症诱导等相关的反应。

1.3 TLR4的信号传导通路

近年来的研究发现，在目前已知的13种TLRs中TLR4和TLR3信号传导通路与众不同。其中最主要是因为TLR4具有与其他TLRs不同的胞内结构域，从而促使TLR4既能够通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性通路也能够通过MyD88非依赖性通路发挥作用。在MyD88依赖性通路中，TIR结构域衔接蛋白（TIRAP）使MyD88与TLR4结合并形成多聚复合体，其中包括MyD88、白介素-1受体相关激酶4（IRAK4）以及白介素-1受体相关激酶1/2（IL-1 receptor-associated kinase 1/2，IRAK1/2）。再通過复合体中的相关激酶激活肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNFR-associated factor 6，TRAF6）和转化生长因子β激活激酶1（TGF-β-activated kinase-1，TAK1）后，与NF-κB关键调节因子（NEMO）结合促使核因子κB抑制蛋白激酶（IκB）磷酸化。并引起核转录因子（NF-κB）核转位和炎性因子中的肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）表达增加。另外，还可通过TAK1激活c-Jun氨基末端激酶（JNK1/2）、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1/2）和P38，最后激活转录因子活化蛋白-1（AP-1）发挥作用[6-8]。而在MyD88非依赖性通路中，TLR4发生某种特定的内化后进入胞内体通过募集Toll样受体相关分子（TRAM）及Toll样受体相关的干扰素活化子（TRIF）后形成复合体激活TRAF3，通过TRAF3泛素化作用激活TANK结合激酶1（TBK1）和核因子-κB抑制蛋白激酶ε（IKKε）。此后通过TBK1和IKKε促使干扰素调节因子3（IRF3）磷酸化，进而刺激抗炎细胞因子转录及Ⅰ型干扰素的生成[8-9]。

2 TLR4在出血后继发性脑损伤中的作用

2.1 促进神经炎性反应

脑出血后神经炎性反应的发生，通常被认为是其产生继发性脑损伤最为重要的因素，因而近年来深受学者们的青睐。然而脑出血如何通过炎性反应进而诱导继发性脑损伤的发生机制往往极为复杂，通常涉及多条信号通路[10]。因此，我们还需要进一步深入研究。

据最新的研究显示，TLRs信号通路在脑出血后诱发神经炎症，不但可以通过慢性炎性反应抑制突触传递从而影响脑损伤修复通路，还可诱使细胞毒性分子通过血脑屏障，从而在引发继发性脑损害的过程中起到至关重要的作用。并且，通过整理大量的实验研究结果后发现在TLRs家族中TLR4在脑出血后表达增加得最为明显。其中Teng等[11]发现在小鼠脑出血模型建立后的6～72 h内TLR4 mRNA和NF-κB表达量不断增加，并长期维持在较高水平，也只是在脑出血后的第7天才开始有所降低。此后，Sansing等[12]通过比较敲除TLR4基因的小鼠脑出血模型和野生型小鼠脑出血模型，不仅发现缺乏TLR4基因的小鼠CD36、CSF2和趋化因子CX3CL1的基因表达增加。而且还发现血肿周围的巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞中的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子表达水平明显降低[13]。不仅仅只是神经炎性反应明显降低，更为重要的是神经功能也得到了明显的改善。由此，他们推断可能抑制TLR4的信号传导通路是控制脑出血诱发神经炎症损伤的一种潜在治疗手段。如今，该研究已经成为新的关注热点。其中Zhou等[14]将新鲜血液注入9～12周龄的SD鼠的右侧大脑半球的基底神经节处建立脑出血模型，并通过比较采取辛伐他汀治疗和未采取干预手段的脑出血SD鼠，以及采取生理盐水喂养的正常SD鼠的NF-κB、TLR4和IL-1β的阳性细胞表达量以及蛋白表达水平，得出辛伐他汀可以通过抑制NF-κB、TLR4和IL-1β的表达进而保护神经元并减少继发性炎性反应的发生的结论。而后，Liu等[15]也通过动物实验发现抗氧化蛋白1（peroxiredocin 1，Prx1）能够通过激活TLR4炎症信号通路上的ERK1/2和NF-κB并最终产生TNF-α、IL-6和IL-17等炎性因子，并认为阻断Prx1-TLR4信号可能是对抗神经炎症损害的新途径。此后，Du等[16]在C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞中发现长链非编码RNA（lncRNA）Mirt2。当巨噬细胞处于静息状态时，Mirt2低表达，而LPS刺激LPS-p38-STAT1以及LPS-IFN-α/β-STAT1通路的转录，可促进lncRNA Mirt2的表达，并在12 h内达到高峰。但是，当Mirt2被敲除后，LPS将快速激活TLR4炎症信号通路使得炎性因子在20 h内迅速增加，从而产生严重的炎性反应。与此同时，作者通过实验发现LPS是通过激活质膜上依赖于E3泛素连接酶TRAF6的促炎信号通路引发炎性反应。而Mirt2抑制TRAF6的Lys63（K63）连接的泛素化，从而抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的活化减轻炎性反应，并调控巨噬细胞的极化。由此可知lncRNA Mirt2是过度炎症的负反馈调节剂。然而，虽然目前只在巨噬细胞、气管上皮细胞和肝细胞中发现Mirt2的炎症调节功能，但是Mirt2也很有可能是调节脑出血后继发性神经炎性反应的关键因素之一。因此，如何将TLR4炎症信号通路进行负性调节，从而减少脑出血后炎症损伤的研究亟待更进一步深入。

2.2 介导神经细胞凋亡

神经细胞凋亡是脑出血后脑损伤较为重要的病理生理过程，主要发生于小胶质细胞、脑血管内皮细胞等中枢神经细胞中，并在早期引发细胞毒性脑水肿、神经功能缺损等不良反应。然而，目前针对脑出血后神经细胞凋亡的机制研究仍处在起步阶段。因此，还需要进一步探索其发病机制。最近有研究表明通过调节TLR4信号通路能够介导神经细胞凋亡。其中Jung等[17]研究发现TLR4的两条信号通路激活均能诱导小胶质细胞的凋亡。首先TLR4通过MyD88依赖性通路激活NF-κB，进而增加含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11（caspase-11）的表达。紧接着激活其下游通路的细胞凋亡执行者caspase-3诱导小胶质细胞凋亡。另外通过诱导一氧化氮合酶（iNOS）产生神经毒性介质一氧化氮（NO）也可以促进细胞凋亡。还可以通过TLR4的MyD88非依赖性通路使得IRF3磷酸化，进而产生干扰素β（IFN-β）。而后IFN-β通过对转录激活因子和信号转导子1（STAT1）进行调控，从而激活STAT1/IRF-1信号通路产生NO激发小胶质细胞凋亡。而Wang等[18]分别采用视交叉前池注血法和颈总动脉-视交叉前池体外转流法建立蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）模型，并从中挑选出最符合实验研究的SAH小鼠，检测出基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、TLR4、caspase3在6、12、24、48、72 h的mRNA表达情况，以及经过LPS预处理24 h后的基因表达情况。最终同样发现TLR4可以通过识别HMGB1开启信号传导通路使得MMP-9表达上调并启动凋亡程序。但经过低剂量LPS预处理后，TLR4信号通路激活反而使得MMP-9和caspase3表达下调从而抑制细胞凋亡并产生神经保护作用。因此这也为治疗由SAH所导致的包括细胞凋亡性损伤在内的早期脑损伤提供了新的方向。此后，Hu等[19]在建立脑出血模型的Wistar鼠中通过腹腔注射不同剂量的银杏内酯B（GB），并观察不同时间段内脑组织中TLR4和NF-κB的基因表达情况以及TNF-α、IL-1β、IL-6和凋亡神经元数量变化情况。最终发现GB能够通过抑制小胶质细胞中TLR4和NF-κB的基因表达，减少炎性反应的发生，进而抑制神经细胞凋亡。而Huang等[20]通过类似的方法发现氧化苦参碱也能够通过抑制TLR4信号通路减少12/15脂氧（12/15-LOX）、磷酸化后的p38丝裂原活化蛋白激酶（phospho-p38 MAPK）和胞浆型磷脂酶A2（cPLA2）所引发的氧化性脑损伤，进而减少脑出血后神经细胞凋亡的数量。最近，Chen等[21]通过比较被敲除TLR4基因的脑出血小鼠和正常的脑出血小鼠分别经过逐瘀安脑丸治疗后凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2在脑组织中的含量变化，最终发现缺乏TLR4基因的小鼠经过逐瘀安脑丸治疗后Bax蛋白表达明显降低，并伴随着Bcl-2蛋白表达明显增加。因此作者认为逐瘀安脑丸可能作用于TLR4信号通路使脑出血后脑损伤所介导的神经细胞凋亡发生率降低，但具体是药物何种成分发挥作用还需进一步研究。

2.3 引发脑血管痉挛

脑血管痉挛是一种因颅内动脉受到出血刺激后产生持续性收缩，从而导致脑组织处于短暂性缺血状态，并由此引发一系列脑缺血性神经功能障碍的脑血管疾病。它最早在1859年被发现并报道，但当时人们还并不知道它是如何产生并导致患者死亡。随着医疗技术的发展人们慢慢地揭开了它的神秘面纱，并在1951年研究人员通过脑血管造影发现脑底动脉环处的动脉瘤破裂引发SAH是脑血管痉挛最主要的发病原因。而如今，学者们虽然通过对脑血管痉挛不断深入的认识，并研究出许多关于SAH后脑血管痉挛治疗的新方法、新技术，而且患者的治疗也从原来的各种擴血管药物治疗、手术治疗，到近年来通过缺血预处理来有效地预防动脉瘤性SAH后脑血管痉挛的发生[22]。但是，由于脑血管痉挛的发病机制仍笼罩在迷雾中，使得针对其治疗的有效性一直无法得到提升。然而，神经学领域的专家通过多年来对SAH动物模型研究发现，SAH后脑血管痉挛的发生与TLR4信号通路传导有着密切的关系。其中Suzuki等[23]在动脉瘤性SAH发生脑血管痉挛患者的脑脊液中发现肌糖蛋白C（tenascin-c，TNC）明显增加。而后，Fujimoto等[24]将TNC注入正常小鼠脑池内促进大脑动脉的平滑肌层不断收缩，并通过蛋白质免疫印迹（Western blot）技术观察到TLR4的表达水平以及MAPK家族中的JNK和p38的磷酸化水平明显增加。最终作者综合实验结果认为脑血管痉挛可能和TLR4激活MAPK信号通路密切相关，然而MAPK信号通路如何诱导SAH后脑血管痉挛的发生还无从得知。但最近Wu等[25]通过整理分析发现血管壁细胞增殖、血管平滑肌的持续收缩、免疫炎性反应、血管内皮细胞凋亡等可能是其作用机制。因此抑制TLR4/MAPK/NF-κB炎症信号通路传导也许是治疗脑血管痉挛的方法之一。基于上述猜测，Kawakita等[26]通过IAXO-102选择性地抑制TLR4受体的白细胞分化抗原14（CD14）和髓样分化蛋白-2（MD-2）后，脑血管的内皮层以及平滑肌细胞层的环氧合酶-1（COX-1）明显减少，并最终抑制SAH后脑血管痉挛。而后，Wu等[27]采用双出血注射法制备SAH模型，并通过Western blot发现腹腔内注射罗格列酮后不仅使得基底动脉周边的TLR4表达明显减低，而且细胞间黏附分子1（IACM-1）以及髓过氧化物酶（MPO）也明显减少。最终，作者认为SAH经罗格列酮预处理后通过抑制TLR4的信号通路，不仅能减少炎性反应，还能使SAH后脑血管痉挛得到缓解。然而经过大量的实验研究发现TLR4拮抗剂并不能完全有效地控制脑血管痉挛的发生。最近Hanafy[28]提出的新观点值得进一步思考，他认为脑血管痉挛治疗较为棘手是因为脑血管痉挛分为早期脑血管痉挛和晚期脑血管痉挛，其中早期脑血管痉挛通过MyD88依赖性通路，而晚期脑血管痉挛通过MyD88非依赖性通路，因此针对不同时间点采取不同的治疗措施或许能够进一步提升疗效。

2.4 诱发脑积水产生

急性出血性脑卒中并发脑积水产生在临床上较为常见，其中脑室穿刺引流是最主要的治疗手段。然而行脑室穿刺引流主要是因为发生了梗阻性脑积水或交通性脑积水后脑脊液循环受阻或吸收障碍。尤其是针对交通性脑积水，临床上只一味地行脑室外引流或腰椎穿刺来减轻脑脊液的吸收障碍，却对其形成机制知之甚少。但是在20世纪90年代，Tada等[29]发现通过鞘内注射人重组转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）后可以诱导小鼠交通性脑积水产生。而后，Kitazawa等[30]通过酶联免疫吸附实验分别检测SAH伴脑积水形成和SAH后无脑积水形成患者脑脊液中TGF-β1含量变化，并通过Western blot来检测脑脊液中TGF-β1表达水平。最终作者根据研究结果认定TGF-β1在SAH患者产生交通性脑积水过程中起到了至关重要的作用。随着时间的推移，人们也逐渐认识到TGF-β1是通过促使蛛网膜下腔纤维化而引发蛛网膜颗粒及其软脑膜脑脊液区域阻塞，并最终由此诱发脑积水。而与此同时血管内皮生长因子（VEGF）、MMPs等也被发现与脑积水产生有着千丝万缕的联系[31]。但是Kaestner等[32]通过临床研究发现TGF-β1在SAH和脑室内出血后脑积水产生中并没有起到决定性作用。而且也没有充分的实验证据证明其他的脑积水相关分子在脑出血后脑积水产生中起到主导性作用。因此关于脑积水产生的机制研究还需更进一步深入。

目前，研究人员对此提出了不同的见解。他们认为我们不能将思维仅仅局限于脑脊液循环失衡导致脑积水产生，而忽略脑脊液分泌增加在疾病发生过程中的潜在作用。对此，Karimy等[33]通过研究小儿脑积水发现脑脊液的分泌是通过物质的跨膜转运完成。其中脉络丛上皮基底侧膜上的水通道蛋白1（aquaporin1，AQP1）、阴离子交换蛋白2、Na+-HCO3-交换蛋白和K+通道将Na+、K+、Cl-、HCO3-和H2O从血液转运至脉络丛上皮。而脉络丛上皮顶端膜上的Na+/K+-ATP酶、Na+-K+-2Cl-共转运体1（Na+-K+-2Cl- cotransporter 1，NKCC1）、Na+-HCO3-共转运体2、K+-Cl-共转运体4（K+-C1- and cotransporter 4，KCC4）和AQP1等共同作用将Na+、K+、Cl-、HCO3-和H2O从脉络丛上皮释放至脑脊液。相反，各种转运体及转运蛋白也可以将各种离子回收至脉络丛上皮，从而抑制脑脊液过度分泌。但是当脉络丛上皮受到某种刺激造成各种离子通道、转运蛋白以及水通道蛋白发生紊乱时，脑脊液的分泌和重吸收失衡能够促使脑脊液大量释放引发脑积水。尤其是受STE20/SPS1相关脯氨酸/丙氨酸丰富的蛋白激酶（STE20/SPS1-related proline/alanine-rich kinase，SPAK）高度调节的NKCC1对细胞内Cl-浓度变化、细胞渗透压以及炎性反应等极其敏感。因此当脉络丛上皮细胞的内环境发生某种变化时，NKCC1表达增加可能会产生一系列连锁反应，诱使脑脊液过度分泌。基于上述推断，有研究发现，动物体内注射一定剂量的丁苯氧酸和呋喃苯胺酸分别抑制NKCC1和KCC可以减少脑脊液的产生[34-35]。而Chen等[36]通过敲除短暂性脑缺血模型小鼠的NKCC1基因后发现脑水肿体积减少了40%。但最近Karimy等[37]的发现进一步揭示了各种离子通道的信号转导在脑出血后脑积水产生中的作用。他首先向大鼠脑室内注入不含LPS的自体血，建立脑积水模型，然后通过导管注射矿物油至第四脑室和中脑导水管，以阻断脑脊液循环，最后将毛细导管插入侧脑室计算脑脊液的实际产出量以及脑脊液分泌率。最终作者发现脑室内出血后脑脊液过度分泌的分子机制为TLR4通过MyD88依赖性通路激活NF-κB后再次激活SPAK，后者与NKCC1结合后使其磷酸化，最终激活NKCC1，引起脑脊液分泌过量。而后，他们先后敲除TLR4基因和SPAK基因后发现脑脊液分泌正常，并且脑积水症状显著减轻。同样，通过瑞沙托维抑制TLR4，吡咯烷二硫代氨基甲酸抑制NF-κB，克罗散泰抑制SPAK，布美他尼抑制NKCC1或使用STOCK1S-50699破坏SPAK-NKCC1共转运体复合体也能达到相同的疗效。因此作者认为通过药物干预信号转导或许能够有效地增加脑出血后脑积水的治愈率，但由于缺乏临床试验研究尚未应用于脑室出血后脑积水的患者。倘若今后的研究证明该信号转导通路存在于人体内，或许针对脑出血后顽固性脑积水的治疗能够迎来新的曙光。

3 展望

出血性腦卒中后继发性脑损伤的产生通常需要经历多个复杂的病理生理过程。其中TLR4分子在各种不同类型的损伤过程中都发挥了一定的作用，并且对TLR4及其下游通路的抑制往往能够起到相应的保护作用。而最近报道的首例高活性的TLR8抑制剂值得进一步关注，因为以往的TLR抑制剂一般是通过阻断TLR形成二聚体，而最新发现的小分子抑制剂能够通过牢牢地锁定已形成的TLR8二聚体的构象，从而起到信号传导的阻断作用[38]。虽然它只是TLRs中的一员，但是它为TLR4及其他TLR抑制剂的研究带来了新的思路。因此我们有理由相信，通过更深层次地挖掘TLRs与出血性脑卒中后继发性脑损伤的联系，能够为继发性脑损伤的治疗开拓新的道路。

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（收稿日期：2018-07-26  本文編辑：罗乔荔）