黄韧带退变的病理改变与分子机制的研究进展

吴海桓 陈 锋 闫 乾 黄知见 廖星栋 李枝发

(1 广西中医药大学研究生学院，南宁市 530001，电子邮箱：396108643@qq.com；2 广西中医药大学附属瑞康医院脊柱外科一区，南宁市 530001)

【提要】 黄韧带退变是引起脊柱退行性疾病的病理基础，是造成椎管狭窄的主要原因，主要病理变化为黄韧带肥厚、钙化和骨化，其发病机制目前尚未完全明确。本文分别就黄韧带肥厚、钙化和骨化的病理改变与相关的分子机制做一综述。

黄韧带是相邻椎弓板间的重要连接结构，参与椎管后壁的形成，可限制椎体过度屈曲，保持脊柱稳定性，其主要成分为胶原纤维、弹力纤维、网状纤维和细胞基质，其中弹力纤维所占比例约为80%[1]。随着年龄增长，黄韧带厚度增加，弹性减低，并出现钙化、骨化[2]；机体后伸时黄韧带可发生皱褶而突入椎管造成椎管狭窄，可引起脊髓和相应节段的神经受压症状。黄韧带退变的主要病理变化为黄韧带肥厚、钙化和骨化，但其发病机制目前尚未完全明确。本文就黄韧带退变的病理改变与相关的分子机制做一综述。

1 黄韧带肥厚

黄韧带肥厚是指黄韧带发生增生、肥厚，是长期的退行性病理改变，是造成腰椎管狭窄的重要原因。病变部位常见于腰椎(L4～L5高发)，颈椎及胸椎发病较少。目前普遍认为黄韧带肥厚的机制是韧带在机械应力-炎症反应-瘢痕的修复过程中逐渐发生纤维化，是继发于年龄或腰椎力学失稳的退行性改变。

1.1 黄韧带肥厚的病理改变 有学者[3-5]通过对椎管狭窄症患者的黄韧带标本进行病理学观察，发现退变的黄韧带厚度增加，弹性纤维减少、排列紊乱且分布不规则，胶原纤维数量增多，同时可见成纤维细胞、毛细血管增生，提示黄韧带退变过程中弹力纤维与胶原纤维含量失调。随着黄韧带肥厚的不断进展，胶原纤维大量增生取代弹性纤维，细胞外基质胶原沉积和血管增生，最终可形成纤维瘢痕[6]。Sairyo等[7]研究发现，在肥厚的黄韧带中出现严重纤维化，纤维化的程度与黄韧带厚度成正比，且在肥厚的黄韧带中检测到炎症因子的表达，并证实黄韧带肥厚与组织损伤引起的炎症反应、瘢痕修复有关，即黄韧带肥厚实质上是韧带组织纤维化病理修复过程。

1.2 机械应力 机械应力是黄韧带肥厚发生的起始因素，可引起炎性细胞因子的释放，进而引起黄韧带纤维化和瘢痕形成。Nakatani等[8]通过设计细胞拉伸装置，对黄韧带细胞施加连续的机械应力，结果显示转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1含量表达与应力强度呈线性相关，同时发现黄韧带中Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维表达增加，表明机械应力引起TGF-β1异常表达是黄韧带发生纤维化的重要原因。TGF-β1是一种促纤维化的细胞因子，能够促进细胞外基质Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维表达。Nakamura等[9]发现，在机械应力作用下，成纤维细胞中血管生成素(angiopoietin,ANGPT)12和TGF-β1 mRNA表达增加，其原理可能是机械应力通过激活钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)信号通路而增加血管生成素样蛋白(angiopoietin-like protein，ANGPTL)12的表达和分泌。ANGPTL12为慢性炎症介质，能加速多种非感染炎症疾病的病程，其在成纤维细胞中通过活化TGF-β1/Smad信号通路诱导TGF-β1的产生，从而引起黄韧带纤维化。ANGPTL12还可以通过激活核因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路活化白细胞介素(interleukin,IL)-6的表达进而引起无菌性炎症，从而导致纤维化[10]。因此，机械应力可通过诱导黄韧带局部炎性细胞因子的释放而引起胶原纤维基因表达增加和炎症反应的发生，从而导致纤维化。

1.3 黄韧带肥厚的相关细胞因子 黄韧带肥厚的形成有多种细胞因子参与。TGF-β1和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)在黄韧带肥厚的发生发展中起重要作用。TGF-β1是一种促纤维化细胞因子，可刺激不同组织产生细胞外基质，如胶原蛋白、纤维连接蛋白和糖蛋白等[11]。TGF-β1的过度表达可导致组织纤维化和器官功能障碍。Ignotz等[11]通过观察大鼠成纤维细胞发现，加入TGF-β1后胶原蛋白Ⅰ和纤维连接蛋白mRNA表达明显增高，并伴有细胞外基质增生。Amudong等[12]对30例腰椎管狭窄症患者的黄韧带进行免疫组化检测，发现在肥厚的黄韧带中TGF-β1 的表达显著高于健康对照组。Sairyo等[13]从退变的黄韧带观察到，TGF-β1 mRNA在黄韧带退变早期的表达量最高，而在后期明显减少，且与黄韧带的厚度呈负相关。付小兵等[14]通过皮肤瘢痕实验发现，TGF-β1 mRNA在瘢痕形成早期呈高表达，而在形成后期表达减少，且发现TGF-β1主要来源于巨噬细胞和血小板。提示TGF-β1在黄韧带肥厚早期参与损伤修复，介导纤维胶原合成；而在纤维化后期，TGF-β1含量减少的原因可能是有其他炎症细胞因子参与并且负反馈抑制其表达。CTGF是一种促纤维化因子，其参与纤维化过程，能够促进细胞增殖、迁移、黏附及细胞外基质合成和新生血管形成。Zhong等[15]通过细胞离体实验发现，加入CTGF后的黄韧带细胞中Ⅰ型、 Ⅲ型胶原纤维表达增高，并发现其含量与黄韧带厚度成正比，表明CTGF与黄韧带肥厚具有相关性。Cao等[16]通过细胞培养发现，TGF-β1 通过激活P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路介导调控 CTGF 蛋白和Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维表达。

2 黄韧带钙化

黄韧带钙化是指黄韧带发生钙质沉积，是一种二羟焦磷酸钙晶体沉积症。病变部位常见于颈椎C5～C6节段，胸腰椎少见[17]。黄韧带钙化是引发颈椎退行性改变、造成脊髓和相应神经根压迫的重要原因，其形成机制目前尚不明确，可能与年龄增加、内分泌代谢异常及颈椎机械应力异常所致慢性损伤等相关[18]。

2.1 黄韧带钙化的病理改变 有学者收集了黄韧带钙化标本并研究了其病理改变，发现黄韧带厚度明显增加,钙化灶形状多为圆形或类圆形，其内容物为骨砂样或胶乳样物质[19]；光镜下可见弹力纤维萎缩断裂且排列紊乱,其数量明显减少而胶原成分增加；钙盐沉积于纤维或软骨基质中，钙化灶周围有较多的组织细胞、淋巴细胞，多核巨细胞浸润并呈异物肉芽肿表现[18-20]。透射电子显微镜下钙化物主要有柱状、粒状、球状和絮状4种形态，柱状和粒状钙化物颗粒边角锐利，晶形明显；球状和絮状钙化物颗粒晶形较差,为多晶集合体形态，长径约0.5～12 μm,宽径约0.2～2 μm。扫描电子显微镜下可见柱状、粒状钙化晶体依附于胶原纤维生长，晶体长轴与胶原纤维走向大致平行；球状和絮状晶体聚集于柱状、粒状晶体附近，与胶原纤维间联系较差，结构呈疏松的晶体混合体。同步辐射X射线衍射分析证实黄韧带钙化灶的成分为焦磷酸钙二水合物晶体，钙化物相分别为三斜焦磷酸钙和碳羟磷灰石[21-22]。刘偌麟等[23]认为，黄韧带钙化过程中，首先形成柱状与粒状的二羟焦磷酸钙晶体，然后钙化集合体发生二羟焦磷酸钙的分解和碳羟磷灰石的沉积，并认为前者的分解为后者的沉积提供物质来源。

2.2 黄韧带钙化相关细胞因子 黄韧带钙化进程有多种细胞因子参与其中。Mwaka等[24]发现，在脊髓型颈椎病的黄韧带钙化灶周围软骨细胞大量增殖，且软骨细胞内S-100蛋白、Sox9基因、TGF-β和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)呈阳性染色，而采用TUNEL法检测钙化结晶处的软骨细胞呈显著表达。S-100蛋白是钙结晶的特异性结合肽，能够与细胞因子共同作用加速软骨细胞钙化。年龄的增长和雌激素水平下降可引起体内钙离子分布异常，体内骨钙含量减少、游离钙增多可造成黄韧带弹性纤维钙质沉积，加速钙化形成[25]。Chen等[26]通过培养人体黄韧带细胞，发现雌二醇通过磷脂酰肌醇3-激酶信号通路途径调节基质金属蛋白酶-13的表达，进而加速成纤维细胞与间充质细胞的细胞分化，雌激素能以时间和剂量依赖的方式增强软骨细胞的增殖活性和胶原分泌，说明雌激素的减少可能会加速黄韧带钙化形成。

3 黄韧带骨化

黄韧带骨化是脊柱韧带出现异位骨化的常见疾病，在脊柱各个节段均可发生，好发于胸椎尤其是下胸椎(T9～T12)，是造成脊髓受压和椎管狭窄的主要原因[27]。黄韧带骨化好发于亚洲黄种人群，以日本最为多见，存在着明显的种族地域差异，其发病机制目前还未完全明确，主流观点认为与遗传因素、种族差异、代谢紊乱、内分泌失调及相应的分子调控异常相关[28-29]。

3.1 黄韧带骨化的病理改变 黄韧带骨化属于典型软骨内成骨过程，由浅至深可划分为韧带区、软骨样区、钙化软骨区、骨化区。组织病理学变化为弹性纤维减少，胶原纤维增生，同时局部的成纤维细胞软骨化生为纤维软骨细胞，软骨基质增生形成软骨；然后钙盐沉积发生钙化，新生血管长入软骨，诱导间充质细胞分化为成骨细胞，分泌骨基质最终形成骨化[30]。黄韧带骨化的发生与椎体的解剖结构有密切关系。Maigne等[31]研究发现，椎体关节突关节的活动度与黄韧带微损伤及其骨化发生率呈正相关，认为黄韧带骨化多发于旋转角度较大的下胸椎T10～T11。Kaneyama等[32]报道了2例无系统疾病和家族病史的年轻棒球运动员胸髓受压病例，认为胸腰段反复的局部旋转机械应力可能是导致黄韧带骨化发生的重要原因。Cai等[33]通过对黄韧带细胞施加机械张力，发现转录因子Sox9、Runt 相关转录因子 2 、β-链蛋白和骨桥蛋白的 mRNA 表达水平显著高于正常黄韧带细胞。Fan等[34]发现机械应力通过锌指结构转录因子osterix诱导黄韧带细胞成骨分化，osterix 是感受应力刺激并调节成骨分化的关键因子。上述研究说明机械应力可以引起细胞因子、生长因子和转录因子的表达增加，加速软骨细胞的成骨分化。

3.2 黄韧带骨化相关细胞因子 黄韧带骨化发生、发展与许多细胞因子具有密切的联系，骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-2和TGF-β1在黄韧带骨化进程中起关键作用。BMP-2是唯一能诱导异位骨化的蛋白因子，其能诱导黄韧带成纤维细胞分化为软骨细胞。Hou 等[35]通过大鼠模型实验发现BMP-2 诱导的骨化为典型的软骨内成骨，类似于临床黄韧带骨化的病理特征。TGF-β1在骨化进展中起重要促进作用。Canalis等[36]观察了胎鼠颅骨培养的成骨细胞，发现TGF-β1能够加速成骨细胞的DNA合成，而对骨钙素合成和碱性磷酸酶活性没有影响，说明TGF-β1可以加速成骨细胞的增殖，但没有诱导成骨的能力。Tou等[37]认为TGF-β1通过上调骨化韧带细胞核心结合因子α(core binding factor α,Cbfa)mRNA表达，进而促进骨质的形成与发育成熟；Cbfa是诱导成骨细胞发生及分化的骨特异性转录因子，对骨的生长发育有重要作用。BMP-2和TGF-β1在骨化进程中起着相互促进的作用。张颖哲等[38]通过干扰小鼠黄韧带细胞TGF-β1基因的siRNA载体，发现可以有效抑制内源性BMP-2表达,表明TGF-β1与BMP-2之间存在密切关系。谭祖键等[39]将BMP/TGF-β1载体植入大兔骨缺损模型，发现骨痂出现时间及骨连接发生时间均明显提前，认为TGF-β1可加速细胞增殖与基质钙化，从而促进BMP诱导成骨。

综上所述，黄韧带退变的发病机制目前尚未完全明确，可能是多种致病因素共同作用的结果。黄韧带肥厚、钙化和骨化三者之间为相互独立的病理过程，相关的病理改变与分子调控具有各自的特异性。因此，需要更加深入研究黄韧带退变的发病机制，明确黄韧带肥厚、钙化和骨化各自发生发展的过程。