猪流行性腹泻研究进展

田 琴， 李 晨， 蒲翠敏， 周 怡， 张明华， 周碧君，2，3， 程振涛，2，3， 文 明，2，3， 王开功，2，3∗

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病研究室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病防控与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性、高度接触性肠道传染病[1]。各个日龄的猪群均可感染，临床症状主要表现为严重腹泻、呕吐、脱水以及食欲下降等，给许多国家养猪业造成巨大的经济损失[2，3]。PED在冬季和春季极易发生，夏季相对较少，猪的年龄越小发病率越高，其中对哺乳仔猪危害最为严重[4]。PEDV引起的临床症状与传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(PoRV)有许多相似之处，应注意这3者之间的区分[5]。自2012年以来，我国各地猪群暴发的腹泻疫情中PEDV是主要病原[6]。PEDV感染后发病率可高达100%，死亡率为30%～80%，是导致仔猪在早期发生死亡的主要疾病之一[7，8]。

1 发展史

1.1 国外PED于20世纪70年代初期在英国、比利时发生并造成小范围流行，1978年首次从腹泻仔猪体内分离到该病病原，并命名为PEDV[9]。其他一些国家也逐渐分离到了PEDV流行毒株，但并未形成大范围的流行。1990—2000年日本、韩国、中国等亚洲东部国家暴发PED，对当地养猪业造成了严重的经济损失。1993年日本、荷兰、匈牙利、英格兰等欧洲国家也逐渐发生PED流行。2007年泰国暴发PED，新生仔猪的死亡率高达100%，流行毒株基因的遗传进化分析证明，泰国流行毒株与2006年中国多地区流行毒株同源性达到96.5%～99.7%，提示1种新型PEDV在亚洲地区出现，并威胁着养猪业发展。2010年后PED在全球各个国家均发生了大面积的流行[10，11]。

1.2 国内我国在1976年首次报道该病，此后国内的各省份都陆续有PEDV感染报道[12]。1984年有研究学者通过荧光抗体实验、血清学实验等证实了该病在我国的存在，并从南方到北方出现了全面的暴发。特别是在2010年以来，广东、广西、四川等南部省区先后暴发PED，给我国养猪业造成了非常严重的经济损失[13]。此病在目前没有减轻的趋势，且目前研发的疫苗免疫很难控制疫病流行。饶永恕等[14]在2011年对PEDV的M基因进行分析，说明2013年河南省流行的PEDV是1个新的基因型，可能起源于泰国或者韩国。疫苗免疫失败和仔猪死亡率高的主要原因可能是病毒基因型改变。2010年冬季的大暴发可能是病毒长期衍生和适应性累加的结果[15]。乐正中[16]等 1985年采用免疫荧光直(间)接染色法、免疫荧光抑阻试验、ELISA法、SPACOA法证明贵州省的贵阳、遵义、安顺等地区存在PEDV感染。蒲翠敏[17]等成功建立了 PEDV、TGEV、PoRV三重PCR检测方法并发现有3种病毒混合感染的情况。

2 病原学与致病机理

2.1 病原学PEDV属于尼多病毒目，冠状病毒科，甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus)的成员，是单股正链RNA病毒。虽然PEDV只有1种血清型，但是分子生物学分析结果表明，其基因组存在基因多样性[18]。此病毒的参考毒株为CV777病毒，形态略呈球形，存在于粪便中的病毒粒子常呈现多形态，平均直径为130 nm(95～190 nm)，有囊膜和纤突，具有侵染性。其基因组全长约28 kb，基因的全长为27 000～33 000个核苷酸，包括5’端有帽子结构(cap)，3’端有poly(A)尾。编码 4个结构蛋白 (S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)和 3个非结构蛋白(复制酶1a、复制酶1b和ORF3)[19]。其中，S与M蛋白是决定病毒侵袭与增殖的主要糖蛋白，也包含诱导机体产生中和抗体的主要抗原表位。此外，S与M基因也被广泛应用于PEDV的分子流行病学调查[20]。PEDV对有机溶剂的抵抗力较弱，乙醚、氯仿、甲醛等均可以使其失去感染性；pH值＜4的酸性消毒液与pH值＞9的碱性消毒液处理也可使病毒灭活，但PEDV对温度的抵抗力相对较强，4～5℃环境中保存6 h仍具有感染性[21]。

2.2 致病机理病毒经口和鼻感染后，直接进入小肠。通过免疫荧光和电子显微镜检查，病毒的复制是在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行，其他脏器内未发现病毒增殖。由于病毒增殖首先造成细胞器的损伤，继而出现细胞功能障碍。肠绒毛萎缩造成吸收表面积减少，小肠黏膜碱性磷酸酶含量显著减少进而引起营养物质吸收障碍，这是引起腹泻的主要原因，属于渗透性腹泻。严重腹泻引起脱水是导致病猪死亡的主要原因。

3 流行病学

3.1 流行病学特点PED的发生有明显的季节性，通常于冬季12月至次年的2月发病，有时夏季也会发病。该病易感染各种日龄的猪，哺乳期、断奶期和育肥期感染率达15%～90%，仔猪死亡率为50%，日龄越小被感染的概率越大。断奶猪、育肥猪感染该病后症状比较轻，成年猪则主要表现为呕吐和厌食等症状[22]。自20世纪80年代国内首次报道发现该病毒至今，猪的感染率在我国呈现逐年升高的态势，虽然疫苗在一定程度上起到了保护作用，但是在2010年之后该病在我国又有流行的趋势[23]。

3.2 易感动物本病只发生于猪，各种年龄的猪都能感染发病。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重。母猪发病率变动很大，为15%～90%。

3.3 传染源PED属于急性、接触性肠道传染病，主要传染源为发病猪和带毒猪，及其排出的带毒粪便或污染物。被PEDV污染的运输车辆、水源、饲养员衣服鞋子等也可成为间接感染的传染源。PEDV暴发疫区感染率可达100%，虽然有些猪群的死亡率较低，但存在持续带毒的情况，会不断排出带有PEDV的粪便，对猪舍造成污染，被健康猪带到其他猪舍也会造成传播。其次，由于多种因素的影响，带毒的猪肉产品进入市场，特别是在猪大肠清洗过程中随意将污水排放，对周围的养殖场和水源造成污染，都是导致PEDV传播的传染源[23]。

3.4 传播途径主要传播途径是消化道。如果1个带毒猪场陆续有仔猪出生或断奶，病毒会不断感染失去母源抗体保护的断奶仔猪，使本病呈地方流行性，可造成5～8周龄仔猪的断奶期顽固性腹泻。

4 临床症状

自然感染潜伏期一般为5～8 h，人工感染潜伏期为8～24 h。主要临床症状为水样腹泻，或者在腹泻之间有呕吐，呕吐多发生于吃食或吃奶后。症状的轻重随年龄的大小而有差异，年龄越小症状越重。1周龄内新生仔猪发生腹泻后3～4 h呈现严重脱水而死亡，死亡率可达50%～100%。病猪体温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝。断奶猪、母猪常表现精神委顿，厌食，持续性腹泻大约1周，后逐渐恢复正常，少数猪恢复后生长发育不良。肥育猪在同圈饲养感染后都发生腹泻，1周后康复，死亡率1%～3%。成年猪症状较轻，有的仅表现呕吐，重者水样腹泻3～4 h可自愈。

5 病理变化

5.1 眼观病变特征性的病理变化主要见于小肠:小肠肠管扩张，内容物稀薄，呈黄色、泡沫状，肠壁弛缓、缺乏弹性、变薄有透明感，肠黏膜绒毛严重萎缩。25%病例胃底黏膜潮红充血，并有黏液覆盖，50%病例见有小点状或斑状出血，胃内容物呈鲜黄色并混有大量乳白色凝乳块(或絮状小片)，较大猪(14日龄以上)约10%病例可见有溃疡灶，靠近幽门区可见有较大坏死区。

5.2 组织学病变显微镜下可见小肠绒毛缩短，上皮细胞核浓缩，胞浆嗜酸性变化。腹泻严重时，绒毛长度与隐窝比值由正常的7∶1降为3∶1。显微病变从十二指肠至回肠未端，呈斑点状分布，受损区绒毛长度从中等到严重变短，变短的绒毛呈融合状，带有发育不良的刷状缘。

6 诊断

目前用于该病的诊断方法主要有病原检测技术、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光定量PCR技术、反转录酶链式反应 (RT-PCR)检测法、多重 PCR技术、胶体金免疫技术等[24，25]。要确诊该病必须结合各种检测手段进行综合判定。

6.1 病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定技术是检测病毒的主要方法，也是最切实可行的方法[26]。收集病猪空肠和肠内容物，用加有双抗的PBS(磷酸盐缓冲液)配成5倍悬液离心，将离心后的上清液用微孔滤膜过滤，按照一定的比例在单层Vero细胞上接种，放置于37℃培养箱中培养3～4 d，观察细胞病变[27]。感染PEDV的Vero细胞最明显的病变特征是细胞融合，形成多核体，并最终凋亡脱落。另外，也可将PEDV接种鸭小肠上皮细胞系，在胰酶存在的情况下病毒能够迅速繁殖。

6.2 病毒中和试验病毒中和试验是通过中和抗体(NAbs)与病毒粒子的结合阻遏病毒复制周期中的1个或多个步骤，以降低病毒感染力为判定标准的检测方法[28]，如今已普遍用于PEDV特异性抗体的检测。

6.3 酶联免疫吸附试验当前用于检测PEDV抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)主要包括间接法和竞争法2种。间接ELISA使用的抗原主要是全病毒或原核表达的重组病毒蛋白(S蛋白、N蛋白和M截短蛋白)[26]。竞争ELISA主要使用PEDV特异性单抗或多抗，其主要优势在于特异性，但不足之处是其主要依赖于竞争抗体的独特型及其针对靶抗原的特异性[29]。

6.4 荧光定量PCR技术荧光定量PCR与传统的PCR方法相比操作步骤更简便，定量更准确且污染较小，有很好的灵敏度和可重复性[30]。

6.5 反转录酶链式反应(RT-PCR)检测法RTPCR方法简便、快速、灵敏、特异，是实验室中常用的分子生物学诊断方法之一。

6.6 多重PCR技术多重PCR技术是一种特殊形式的PCR，分子生物学的多个领域研究应用到多重PCR，例如病原体鉴定、遗传性疾病诊断等[31]。即在同一PCR反应体系中加入2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。一般PCR仅应用1对引物，通过PCR扩增产生1个核酸片段，主要用于单一致病因子如(PEDV)等的鉴定。

6.7 胶体金免疫技术免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金免疫技术由于灵敏性和特异性高的优势，无需特殊仪器，直接可以判断结果。张利勃[32]等对金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的胶体金进行标记作为指示介质，用重组表达的PEDV M蛋白抗原和抗金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的基因抗体作为检测线和指控线，开发出用于检测PEDV血清抗体的胶体金免疫层析试纸条，试验证明该试纸的灵敏度和ELISA几乎相同，符合率达96%。该试纸还具有灵敏度高、快速等优点，为基层检测抗体提供了方便[33]。

7 防治

7.1 做好药物预防，降低猪群感染本病应用抗生素治疗无效，可参考猪传染性胃肠炎的防治办法。在本病流行地区可在怀孕母猪分娩前2周，以病猪粪便或小肠内容物进行人工感染，以刺激其产生乳源抗体，以缩短本病在猪场中的流行。防治:(1)白细胞干扰素2 000～3 000 IU，每小时1～2次，皮下注射。(2)口服补液盐溶液100～200 mL，1次口服。(3)蜂胶疗法。以每10 kg体重2～3 g蜂胶的用量配制药丸喂服，1次/d，连用3～5 d，效果较好[34]。(4)应用抗生素(青霉素、四环素、庆大霉素)防止继发细菌性感染。(5)中药处方(25 kg以下猪酌减):茯苓 15 g，白头翁 16 g，紫苏 16 g，桂枝 12 g，甘草10 g，木香12 g，双花 15 g，黄芩10 g，生姜12 g，半夏12 g，苍术15 g，加水煎为浓缩药液，灌服[35]。

7.2 做好免疫接种山，提高猪群免疫力我国已研制出 PEDV甲醛氢氧化铝灭活疫苗，保护率达85%，可用于预防本病。也可接种猪传染性胃肠炎、PED二联苗，或猪传染性胃肠炎、PED、猪轮状病毒三联活疫苗。妊娠母猪产前1个月接种疫苗，可通过母乳使仔猪获得被动免疫，也可用猪流行性腹泻弱毒疫苗或灭活疫苗对仔猪进行免疫。

7.3 加强生物安全，防止病原入侵规模化猪场生物安全包括以下2个方面:(1)防止病原进入猪场，防控疫病在猪场内流行或扩散至其他猪场。(2)严格控制人员和物资进出，制定细致的进场人员和物资消毒程序，确保生物安全制度的跟踪落实。

7.4 加强饲养管理，做好环境卫生(1)首先要保证母猪的饲料质量、采食量，提高母猪抵抗力。(2)对仔猪和母猪舍都要勤打扫，做好猪场的环境卫生，做到定期消毒[35]。(3)做好新生仔猪的保温工作，尽快让仔猪吃上初乳，提高仔猪的抗病能力。仔猪出生后1～3 d内及时补充铁制剂，防止缺铁性贫血的发生。(4)分阶段饲养的猪舍要彻底做好全进全出，保证同一猪舍猪群的整体性，便于管理。

7.5 围产期母猪保健，降低仔猪发病率哺乳仔猪发生病毒性腹泻多与母猪带毒有关，应做好以下工作:(1)对产前1周母猪进行保健，可以清除体内毒素，降低体内带毒量。(2)对产后1周母猪进行保健，不仅可以减少母猪产后炎症，还能使仔猪通过母乳获得一定药物，有利于控制仔猪的腹泻。(3)猪场发生腹泻期间，通过在围产期母猪料中加入银翘散＋替米考星，对预防和治疗仔猪的腹泻具有一定效果。(4)平时的围产期保健方案可选用康舒秘＋强力霉素、支原净＋阿莫西林等轮换进行，均可有效减少母猪产后炎症以及仔猪腹泻的发生。

近年来贵州省部分地区PED暴发严重，感染率居高不下，部分猪场初生仔猪大量死亡，造成重大的经济损失[5，36]。原因为运输车辆或人员带入病毒，导致疫情扩散至全群。建议猪场运出或运入猪或物料时加强消毒，并强化饲养人员的消毒意识，进出饲养区时更换运输工具，及时更换衣物并彻底消毒；饲养区内定期采取切实可靠的消毒措施，不同猪舍的饲养器具要分开，饲养人员不互相串舍。发生疫情后及时对病猪进行隔离，并送实验室检测，以便及早针对病因进行治疗，将损失降到最低。同时，做好妊娠母猪的饲养管理、初生仔猪的合理免疫接种和哺乳舍环境卫生工作对于防控PEDV感染具有重要意义。

8 讨论

PED是一种肠道传染病，PEDV的体外繁殖一直制约着该病的深入研究[37]。该病传播迅速，在我国猪场中广泛存在，一旦发病较难控制，若通过投放大量的药物进行预防或治疗，由于药物残留问题会给食品安全带来隐患[38]。目前贵州对PEDV的研究还侧重于病原调查、抗体水平监测、分子生物学等方面[5，39]，在蛋白质水平、疫苗方面的研究内容较匮乏，因此既要研究快速、特异、灵敏的PEDV检测技术，及时发现病毒并进行早期控制，防止疫情的扩散传播，减少损失，又要尽快开发出免疫效果好、特异性高的疫苗进行科学防控。