贵州省首次报道人感染H9N2禽流感病例的病原学诊断及意义

庄丽 王恒 冯蓓 蒋琳 蒋维佳

(1.贵州省疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550004；2.黔西南州疾病预防控制中心，贵州 兴义 562400)

禽流感病毒(AIV)根据致病力不同，分为高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。最常见的低致病性禽流感病毒是H9亚型禽流感病毒， LPAIV虽然发病率和致死率低，但广泛存在于家禽及候鸟中，流行和传播范围较为广泛[1]。人感染H9N2禽流感病例的临床症状较轻，仅表现为轻微流感样症状或肺炎症状[2]。在贵州省禽类外环境标本和候鸟粪便的Real-Time PCR检测中，禽流感病毒H9N2亚型感染率一直保持较高水平，但在贵州省人群监测中从未发现过人感染H9N2禽流感病例，本文监测发现的人感染H9N2禽流感病例为贵州省首次报道。

1 材料和方法

1.1标本来源 贵州省流感哨点监测医院采集符合流感样病例定义的标本。病例定义为发热(体温≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。

1.2患者病史 杜某，女，3岁，发病前有禽类接触史，发热2 d就诊。

1.3标本种类及采集 咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子适度用力擦拭双侧扁桃体及咽后壁，避免触及舌部。将拭子头浸入采样液，弃去尾部。

1.4实时荧光定量(Real-Time)PCR检测[3-5]提取试剂盒为ABI公司 RNADNA核酸提取试剂盒，具体操作步骤见试剂盒说明书。通过 Real-Time PCR方法检测H9N2禽流感病毒。本实验采用达安基因有限公司生产的相关试剂盒进行检测。

1.5MDCK细胞病毒分离 准备75%～90%成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶。在DMEM基础培养液中加入2%青、链霉素母液(终浓度达：100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)；2%牛血清白蛋白组分V(终浓度：0.25%)；2%HEPES缓冲液(终浓度：25 mM)；7.5%的NaHCO3溶液(所加NaHCO3溶液体积为总体积的2%～3%)；1‰的TPCK-胰酶(母液浓度为2 mg/mL)，使TPCK-胰酶的终浓度为2 μg/mL。用PBS缓冲液清洗细胞3遍，吸取1 mL标本置于细胞培养瓶中，放入37 ℃培养箱中吸附2 h。再用PBS缓冲液清洗一遍细胞，加入6 mL病毒培养液，放入37 ℃培养箱培养。接种后每日显微镜下观察细胞病变情况，第5日细胞病变超过75%，收获。用1%红细胞悬液对细胞培养物进行鉴定。

2 结 果

为贵州省某流感样病例监测哨点医院，Real-Time PCR检测结果为通用引物阳性，CT值为32.35，禽流感病毒H9亚型阳性，CT值为33.23，N2阳性，CT值为36.58。MDCK细胞分离的H9N2亚型禽流感病毒，经红细胞凝集试验(HA)检测，HA滴度为1∶16。细胞培养物的Real-Time PCR检测结果显示通用引物阳性，CT值为27.37，禽流感病毒H9亚型阳性，CT值为30.06，N2阳性，CT值为30.03。

3 讨 论

我国已在多种禽类和其他家养动物中检测出H9N2禽流感病毒，并发现多起人感染H9N2禽流感病例[6]。云南省某地活禽市场内宰杀和销售禽类从业人员血清标本中H9N2中和抗体阳性率达到16%，可见人群对于H9N2禽流感病毒易感性远高于H5N1和H7N9病毒，也就是说，一旦H9N2禽流感病毒通过变异或重组获得高致病性，将有可能获得与H5N1禽流感病毒一样的传播能力，完全可以引起流感大流行[7]。

本例患者通过病原学诊断确诊为人感染禽流感H9N2病例，并成功分离出H9N2亚型禽流感病毒，为贵州省首次报道的人感染H9N2亚型禽流感病例。2014～2017年每年冬春季，均要针对贵州省某活禽市场外环境标本连续监测，标本类型包括：禽类粪便、禽类笼具表面拭子、清洗禽类用水、宰杀禽类案板拭子、禽类饮用水等。检测结果显示2014—2016年H9N2禽流感病毒阳性率为20%～51%，一直处于一个较高的水平。于2017年稍有下降，或与当地大规模接种禽类疫苗有关。但一直没有发现人感染H9N2禽流感的报告。很有可能是人感染H9N2禽流感病例的临床症状较轻，并未引起人们重视。本例患者发病时仅有发热及上呼吸道症状，经过常规抗病毒治疗，7 d后痊愈出院。

本病例确诊后，根据其病毒特性，疾控部门采取准确及时有效的防控措施：隔离并消毒禽场和禽舍；对病禽进行处理，严禁病禽或者可疑病禽上市流通；对密切接触者进行隔离观察等措施，防止病毒进一步扩散。