外泌体在胰腺癌诊疗中的临床意义

郑杰，单云峰

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325000，1.介入科，2.肝胆外科）

胰腺癌是全球最致命的癌症之一，其中胰腺导管腺癌（PDAC）占胰腺癌的80%[1]。尽管在过去的30年间胰腺癌的诊断检测与治疗取得了进展，但五年生存率仅为8%[2]。这种低生存率主要归因于胰腺癌诊断时常为晚期，有高转移潜力，治疗选择有限，目前的常规疗法效果不佳[3-4]。手术切除肿瘤仍然是这些患者实现长期生存的唯一希望，但由于PDAC患者在诊断时常为晚期，仅20%的胰腺癌患者可进行根治性切除[4]。此外，手术切除的患者仍有高比例的复发风险，通常在2年内死亡[5]。

外泌体是内吞起源的细胞外囊泡（EV），其大小约30～150 nm[6]。外泌体可由细胞分泌到细胞外间隙并进入血液循环，并可携带反映其源细胞特征的蛋白质、核酸和脂质组等，参与调节细胞间的通讯与行为[7-8]。其中，癌细胞来源的外泌体参与肿瘤微环境的形成，是癌症发生发展的重要因素[8-11]，近年来已成为研究人类癌症的诊断生物标志物和治疗靶标的热点之一[12]。胰腺癌细胞来源的外泌体（PEX）是胰腺癌的肿瘤发生发展的关键因素之一[13]。本文就外泌体对胰腺癌的诊断、治疗及预后检测的临床价值进行讨论。

1 PEX与胰腺癌的诊断

由于胰腺癌潜在发病且缺乏特异的临床表现，大多数患者诊断时往往是晚期[14]。传统的影像学检查，如CT/MRI扫描和内镜逆行胰胆管造影（ERCP）价格昂贵，并且可能存在潜在的诱发风险[15]。CA19-9是目前唯一被批准用于胰腺癌诊断的血清生物标志物，但CA19-9缺乏敏感性和特异性，约25%的患者不升高，且慢性胰腺炎（CP）和高胆红素血症患者的CA19-9水平也会增加[16]。而外泌体由于其生物学特性，在临床诊断方面具有独特优势。首先，胰腺癌细胞产生的囊泡主要是PEX而不是其他细胞外囊泡，PEX内富含大量具有检测价值的标志物[7]；第二，PEX可以从多种体液中非侵入性地收集，并且可以实时监测[12]；第三，PEX具有稳定性，其内容物不受外部核酸酶和蛋白酶的降解[12]；第四，与常规活组织检查相比，PEX分子可以通过RT-PCR和新一代测序检测，相对便捷[15]。

PEX中异常表达的生物分子具有一定的诊断价值。研究报道，胰腺癌来源的外泌体膜中富含一种名为磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（GPC1）的蛋白质，它是多种癌症类型中过表达的膜锚定蛋白[17]，通过启动子的低甲基化在胰腺癌患者中高表达[18]。Melo等[13]研究发现，来自190例PDAC患者的外泌体检测出比健康个体中更高水平的GPC1，对于早期诊断的胰腺癌同时具有100%的敏感性和100%的特异性，并且GPC1阳性PEX的水平可区分I～IV期胰腺癌患者。Yang等[19]建立了包含5种基于EV的蛋白质标志物（EGRF、EPCAM、MUC1、GPC1和WNT2）的联合模型，结果显示其比现有血清标志物CA19-9或任何单一EV标志物具有更高的灵敏度（86%）和特异性（81%），其中包括最佳标志物GPC1的灵敏度（82%）和特异性（52%）。这两项研究中GPC1的抗体及囊泡分离方法可能导致其结果差异，但进一步表明GPC1可能是胰腺癌中有效的早期筛选生物标志物。此外，PC-1.0细胞（一种高度恶性的胰腺癌细胞系）来源的外泌体内含有锌转运蛋白（ZIP4），能够有效区分胰腺癌和良性胰腺疾病、胆道疾病和正常对照，并且ZIP4能够在体外和体内促进PC-1.0癌细胞进展，提示ZIP4可能是胰腺癌的新型诊断生物标志物[20]。

此外，许多研究表明PEX中富含的多种miRNA具有潜在的诊断价值。Lai等[14]的研究表明，高PEX-miR-10b、-miR-21、-miR-30c和-miR-181a以及低PEX-miR-let7a水平能够显著区分早期PDAC与正常组织；另外某些升高的miRNA在PDAC切除术后24 h内降至正常值，表明PEX-miRNA的诊断价值可能优于GPC1。另外，有研究对15例早期胰腺癌及正常组织进行新一代测序，结果发现PEX中高度富集的miR-196a和miR-1246可能是早期检测胰腺癌的潜在生物标志物，其中miR-1246更适用于导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN）[21]。此外，PEX-miR-191、-miR-21和-miR-451a在胰腺癌和IPMN中也显著过表达，其诊断准确度比相应的循环miRNA高5%～20%[22]，其中miR-21还可能与胰腺癌预后有关。另外一项研究证实，PEX中高表达的miR-17-5p和miR-21能灵敏地区分胰腺癌与良性胰腺肿瘤，并且PEX-miR-17-5p可能参与胰腺癌进展[23]。值得注意的是，该研究结果表明PEX中miR-196a较正常U6内参低表达，这与之前一项研究结果不一致。综上，PEX-miRNA在早期诊断方面具有一定的优势，可用于胰腺癌的筛查。目前已有研究团队开发了DSN辅助的双SERS生物传感器，用于外泌体中的microRNA-10b和基于Fe3O4@Ag-DNA-Au@Ag@DTNB缀合物的血液样品检测的残留血浆的检测，对来自PDAC、CP和正常对照的血液样品中的靶miRNA和血液样品的残留上清液直接定量，并且在它们之间可以发现显著的SERS信号区别，以此来精确反映PEX-miRNA，希望实现癌症一步法诊断的即时诊断技术[24]。此外，Nakamura等[25]检测收集27个PDAC与8个慢性胰腺炎的胰液样本，发现PDAC患者中的PEX-miR-21与-miR-155显著高于CP患者，联合胰液细胞学的诊断准确度可达91%，证实胰液中的PEX-miRNA也可作为PDAC的生物标志物。

2 PEX与胰腺癌的治疗

外泌体中携带含有许多生物学功能的小分子物质，同时具备了多种理想材料的特性，使得PEX能够成为胰腺癌的重要治疗靶点。肿瘤来源外泌体可以传递这些“关键分子”到肿瘤细胞中，对肿瘤细胞的存活和生长具有促进作用，这意味着抑制外泌体生成、释放或摄取的药物可能具有治疗癌症的潜能。同时PEX也非常稳定，可以长期储存，适合工业生产。此外，PEX还可以作为“微型抗原呈递细胞”，参与促进宿主组织侵入和随后的免疫应答的转移和逃避过程，具有作为新型免疫治疗剂的应用潜能[26]。本文主要阐述外泌体抑制剂的抗肿瘤作用以及PEX在免疫疗法方面的研究进展。

目前，关于在PDAC免疫疗法中使用PEX的研究仍然很少。最近的一项体内研究表明，常用于PDAC治疗的化疗药物（即全反式维甲-ATRA、舒尼替尼和吉西他滨）与负载PEX的树突状细胞（DC）疫苗相结合，可有效抑制转移瘤的生长，延长胰腺癌小鼠的存活时间[27]。Su等[28]用转染miR-155和miR-125b2的Panc-1细胞外泌体处理，可将M2巨噬细胞重新编程为具有抗肿瘤表型的M1型。因此，应进一步探索生物工程肿瘤外泌体，以表达可导致巨噬细胞表型变化并抑制其免疫抑制和促肿瘤活性的特异性miRNA用于临床研究。另一项研究表明，巨噬细胞来源的外泌体能够在体外和体内显著降低PDAC细胞对吉西他滨的敏感性，用吉西他滨治疗后，Rab27a和Rab27b敲除的小鼠PDAC肿瘤比野生型小鼠更小[29]。尽管该研究的重点不是基于PEX的免疫治疗，但从另一方面表明PEX介导的胰腺癌细胞和免疫细胞之间的细胞间交流可能是导致胰腺癌的预后不良和治疗抵抗的关键因素。同时该研究还表明，化疗药物与Rab27a/b抑制剂或其他外泌体分泌抑制剂的组合可以显着改善患者对胰腺癌的疗效反应。Zech等[30]报道，来自大鼠胰腺癌细胞系BSp73ASML（ASML）的外泌体可通过减少CD44v6、ZAP70和ERK1/2磷酸化来影响白细胞增殖。此外，胰腺癌衍生的PEX通过miR-203下调树突状细胞中的TLR4和下游细胞因子[31]。另外一些研究报道了肿瘤衍生的纳米颗粒对肿瘤细胞可能具有凋亡作用。人胰腺肿瘤衍生的纳米颗粒能够抵消组成型活化的PI3K/AKT存活途径，诱导肿瘤细胞凋亡[32]。而肿瘤外泌体纳米颗粒能够通过与靶细胞的相互作用抑制Notch-1的细胞存活途径，并激活决定肿瘤细胞命运的细胞凋亡途径[33]。

此外，还可以通过抑制癌症来源的外泌体的分泌来触发抗癌免疫应答，从而阻碍癌细胞重编程其微环境能力。吉西他滨与外泌体抑制剂GW4869的联用可以用于预防化疗耐药[34]。但GW4869会同时抑制癌细胞和正常细胞分泌的外泌体，直接抑制外泌体分泌可能会导致正常的细胞功能丧失，因此应慎重选择其适应证。目前相对安全的方法是抑制已知能够实现外泌体的促肿瘤发生和促转移功能的特定蛋白质。例如，有研究发现GAIP-相互作用蛋白C末端（GIPC）是阻断肿瘤细胞自噬的主要调节因子，它通过影响PEXs的生物发生、分泌和分子组成来调节细胞运输途径[35]。另外，GIPC能够耗竭PEX中的抗药性基因ABCG2（一种抗药性蛋白）的过表达，使得肿瘤细胞吉西他滨仍然敏感。因此，GIPC可能是克服胰腺癌化疗耐药的潜在治疗靶点。Hoshino等[9]发现，在PEX中对过表达的ITG4或ITG5的抑制能够显著降低胰腺癌细胞远处转移的能力。此外，其他细胞囊泡运输蛋白也可能在临床治疗中作为靶点，如RAB27A与TP53与胰腺癌的侵袭行为有关[36-37]。另一方面，如果癌症来源的外泌体的特异性靶向成为现实，那么可能会出现一系列新的治疗可能性，从而有可能彻底改变癌症治疗的方式。最近，Datta等[38]通过定量高通量筛选（qHTS）对LOPAC文库和NPC文库两种药物库进行筛选，从中筛选鉴定出能够调节前列腺癌细胞外泌体生物发生和分泌能力的化合物，该研究表明药物再利用可通过影响外泌体而作为晚期癌症的新型辅助治疗策略。

3 PEX与胰腺癌的预后、转移和复发

关于PEX在胰腺癌预后中的作用尚未进行确定的临床研究，但已经有一些研究报道了PEX在胰腺癌中的预后价值。例如PEX-GPC1与术前和术后患者的肿瘤负荷及生存相关，提示其作为胰腺癌预后生物标志物的作用[13]。而胰腺癌中高表达的RAB27A与TP53与预后差有关[37]。PEX-miR-17-5p预测胰腺癌患者预后不良，因为它与炎症反应或肿瘤免疫逃逸有关[23]。MiR-21是另一种PEX miRNA，已被确定为胰腺癌总体存活的候选预后因子[22]。MiR-301a-3p在缺氧条件下选择性包装入PEXs，与浸润深度、淋巴结转移和晚期TNM分期呈正相关，因此是胰腺癌的预后分子[39]。此外，具有肿瘤前胰腺病变的小鼠和患有I期PDAC的患者高度表达PEXMIF，表明PEX-MIF在肝转移之前是可检测的，因此可能具有预后价值。PEX中的DNA也可能具有预后意义，PEX突变体KRAS的纵向监测可以预测局部胰腺癌患者的新辅助治疗结果和转移瘤患者的进展[40]。因此，PEX内容物在预后价值中的判断值得进一步临床研究。

外泌体可以作为介导邻近或长距离细胞间的通讯交流信号，具有符合癌症转移的潜在条件因素[9]。Gesierich等[41]在大鼠胰腺癌研究中发现癌细胞可以大量传递外泌体，这些外泌体起到长距离细胞间通讯的作用，并且是形成转移前生态位的主要成分。另一项研究也表明外泌体在突变CD44介导的转移前生态位形成中起重要作用[42]。最近的一项研究也表明PDAC衍生的外泌体在幼稚小鼠中诱导肝脏转移前的生态位，并增加肝脏转移负荷[10]，该研究还报道巨噬细胞移动抑制因子（MIF）在PDAC衍生的外泌体中高度表达。与胰腺肿瘤无进展的患者相比，I期PDAC发生肝转移的患者外泌体水平显着升高。这些研究结果表明，MIF外泌体水平可作为肝脏转移前生态位形成的早期生物标志物，也可作为肿瘤前病变患者转移风险的预后因素，如胰腺炎、IPMNs和转移前PDAC[10]。总之，研究表明肿瘤来源的外泌体可能参与原发性肿瘤细胞器官特异性转移，但仍需要进一步的研究来确定抑制外泌体功能对转移前的生态位形成及其在胰腺癌中的治疗潜力的影响。

4 外泌体作为给药载体

外泌体可作为肿瘤特异性抗原和免疫调节药物的纳米载体，是有希望治疗癌症的方法之一。外泌体与其他纳米粒子相比具有多种优势，如其本身的内源性特性，并能携带不同类型分子（包括蛋白质、脂质和核酸）的能力[43-44]，同时具备无毒性和非免疫原性。目前应用的纳米载体如脂质体，实际上是基于脂质的纳米载体，脂质体的合成性质和聚合物核心决定了其固有的相关毒性[45-46]。因此，脂质体被普遍认为是外来的，且可引发过敏反应，其特征在于强烈的先天免疫反应[47]。与脂质体不同，外泌体由生物体内的大多数细胞自然分泌[6]，探索患者自身的健康细胞来生产用于癌症治疗的外泌体，可以减少对受体的不良免疫反应[48]。已有研究报道，CD47能够保护小鼠的循环中的外泌体免受单核细胞和巨噬细胞的吞噬作用，依赖这种保护作用，外泌体能够将体内靶向KRASG12D的RNAi分子递送至胰腺癌细胞，并显著提高胰腺癌小鼠存活率，其疗效远高于脂质体[49]。外泌体还可以增强其内容物（特别是RNA分子）的稳定性和生物利用度，避免这些载物在通过循环时被迅速降解[50-51]。另一方面，外泌体的小尺寸使它们能够穿透天然屏障，包括血脑屏障[52-53]，并深入到组织内[54]。外泌体能够被特定的靶细胞吸收，这一过程可能受外泌体表面特异性黏附分子、整合素和四跨膜蛋白的调节[55-57]。例如，表达Tspan8的细胞的外泌体优先被CD54+的胰腺细胞和内皮细胞摄取[57]。因此，未来基于外泌体的疗法可以利用这些特征来靶向特定细胞。但这一特性也表明，不应轻率使用外泌体作为免疫调节药物的载体。外泌体表面蛋白的微小变化可以改变外泌体的特异性，对外泌体生物产生过程及对靶细胞广泛了解是研究基于外泌体的治疗工程所具备的基本要求[57]。外泌体表面特定蛋白的表达可以通过上调源细胞中相关蛋白表达来控制[57-58]。将超顺磁性纳米颗粒锚定到外泌体上可以改善肿瘤细胞的靶向性，外泌体可通过中等磁场“引导”到肿瘤细胞中[59]。进入受体细胞后，外泌体将内容物释放到细胞质中，诱导蛋白质表达[60-61]、信号通路的激活状态[62]和细胞的表型[63-65]等变化。此外，外泌体也可以通过内吞作用进入受体细胞，或通过外泌体膜中存在的蛋白质与受体细胞的质膜融合[43]。因此，外泌体是将免疫调节剂递送到特定靶细胞中以阻断免疫抑制和（或）刺激抗癌免疫应答的潜在工具。这两种方法可以与标准化疗药物联合使用，以最大限度地消除胰腺癌细胞，减小副作用，从而达到手术能够切除肿瘤的目的，提高患者的存活率。

5 目前的局限性和未来的展望

据我们所知，目前在胰腺癌的研究领域，尚未有研究或课题使用外泌体来作为提供免疫治疗药物、抗原、细胞因子或其他免疫刺激分子。基于PEX的多种功能和临床意义，PEX是有潜力的生物标志物和胰腺癌治疗的潜在靶标。许多标志物分子的不同表达赋予PEXs诊断和预后价值。通过细胞间通讯，PEX参与肿瘤细胞的增殖和凋亡，免疫耐受和转移，以及代谢重编程，为胰腺癌提供了各种潜在的治疗靶点。许多研究也证明外泌体分泌的抑制对治疗癌症有效[11，34]。此外，外泌体可能是一种新型的药物递送工具，因为与常规纳米颗粒相比，它具有多种独特的性质。然而，在考虑PEX的临床应用之前，需要解决几个问题。首先，由于缺乏标准化方案，很难比较PEX相关研究中的结果。因此需要建立一套无争议的程序，包括开始样品量、外泌体富集、内容物提取和纯化，以及选择合适的内参对照[11]。其次，PEX的影响取决于其内容物：PEX中既有促癌相关分子，也有抑癌相关分子[66]。评价衡量这种肿瘤负荷平衡也是亟需解决的关键问题。第三，大多数PEX相关研究是在体外进行的，今后的研究应当在这些体外培养体系中使用外泌体制剂来探讨外泌体对细胞的影响，但在这种条件下分泌的外泌体内容物的数量是否会受到影响我们不得而知。第四，当研究体内PEX的功能时，重要的是实现PEX释放的特异性诱导或干扰而不影响EV或其他信号分子的其他亚型的释放。第五，尽管许多PEX内容物是胰腺癌的生物标志物候选者，但目前尚未应用到临床。因此对这些候选基因进行基础研究向临床实践的转化验证也是必不可少的。第六，对血浆和血清以外的生物流体的关注有限。一项研究表明，唾液外泌体是比血清外泌体更好的诊断候选者[67]，这表明在未来的研究中需要更多地关注非常规生物流体。最后，对于外泌体作为胰腺癌的药物递送系统，必须开发适当的方法来改善药物包封、器官向性和外泌体的耐久性。显然，对PEX的研究还处于起步阶段。鉴于PEX的临床意义和该研究领域的挑战，需要更多的努力来深入了解PEX，以促进胰腺癌的治疗和预后。此外，获得用于治疗目的的外泌体的最佳细胞来源仍有争议。我们提倡使用从患者自身分离的健康细胞来获得外泌体，然后可以将其设计为将免疫调节分子携带至特定细胞。结果表明，这些囊泡能够逃避免疫系统并安全地穿过血流以激活针对癌细胞的特异性免疫应答。目前牛乳外泌体由于易分离、易大规模生产和缺乏免疫原性，可作为解决难题的方案之一[68-69]。我们希望今后的研究能够更好地了解使用外泌体的治疗方法的益处和风险，并找到克服目前面临的挑战的新方法。