本事琥珀散对子宫内膜异位症大鼠“3A”模式细胞因子的影响※

刘丹彤 杨学琴 马重阳 罗亚敏 宋慧荣 张小勇

（北京中医药大学中医学院，北京 100029）

子宫内膜异位症（EMs）是指具有生长能力的子宫内膜组织（腺体和间质）出现在子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位的一种疾病，以痛经、性交不适、不孕等为主要临床症状［1］。大约有 3%~10%的育龄妇女患有EMs，而且这个数字还在逐年升高。现代医学对于 EMs的发病机理尚无定论，但可以肯定的是，游离的子宫内膜碎片在形成异位病灶的过程中，必须首先与子宫腔以外的其他部位黏膜产生黏附反应，进而突破细胞外基质和基底膜，形成侵袭性生长，并成功建立血供。这一种植、浸润、发展的过程被称为“3A”模式，包括“黏附（Attachment）-侵袭（Aggression）-血管生成（Angiogenesis）”三个基本环节。“3A”模式中的每个环节都是通过一系列细胞因子的作用而实现的，比如黏附环节的ICAM-1，侵袭环节的 MMP-9和血管生成环节的VEGF等。

本事琥珀散出自宋代许叔微所著《普济本事方》，原方组成为：京三棱、蓬莪术、赤芍药、刘寄奴、牡丹皮、官桂、熟干地黄、菊花、真蒲黄、当归，另有去菊花、蒲黄，而用乌药、延胡索者。全方具有行气活血，温经止痛的功效。后世常用本方治疗以痛经、不孕为主要症状的妇科疾病，亦可治疗 EMs。课题组前期研究已表明，本事琥珀散能够改善EMs大鼠血清免疫相关细胞因子的含量，从而对 EMs产生治疗作用。本研究拟从“3A”模式各个环节的代表性细胞因子入手，探讨本事琥珀散对EMs大鼠的治疗作用，进一步探寻本事琥珀散治疗EMs的作用机制和靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠60只，体质量180~220 g，清洁级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物合格证编号：SCXK（京）2013-0001。饲养环境：室内平均温度 20~25℃，平均湿度40%~60%，12 h昼夜交替，喂以大鼠标准颗粒饲料，自由饮水。

1.2 实验药品 本事琥珀散（全方）：三棱 10 g，莪术10 g，赤芍 15 g，刘寄奴 10 g，牡丹皮 6 g，肉桂 10 g，熟地黄 10 g，乌药 10 g，延胡索 10 g，当归 15 g，乌豆6 g，生姜6 g。药物均购自北京中医药大学国医堂门诊部。西药：丹那唑胶囊0.1 mg/粒（江苏联环药业股份有限公司，批号：20110102）。水合氯醛（天津市光复精细化工研究所，批号：20071129）；注射用氨苄青霉素（中诺药业有限公司，批号：09089024）；己烯雌酚（合肥久联制药有限公司，批号：20080616）；生理盐水［中诺药业（石家庄）有限公司，批号：20090123］。MIF试剂盒（BENDER）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药 适应性喂养5 d，称量体质量后，将56只雌性SD大鼠按随机数字表法分为：空白对照组、伪手术组、模型组、本事琥珀散高剂量组、本事琥珀散中剂量组、本事琥珀散低剂量组和西药对照组等7组，每组8只。各组均采用自体内膜移植法复制EMs模型。于术前第5天和术后第10天开始连续5 d对所有大鼠给予己烯雌酚灌胃0.02 mg/kg，使各组大鼠处于统一的动情期；术后做消毒处理，连续5 d给予氨苄青霉素肌注 16万U/kg。

手术后各组动物休养1周，以便手术伤口愈合，此时各组大鼠需单笼饲养。待手术伤口基本愈合，连续灌胃给药4周。模型组给予生理盐水灌胃，2 mL/d。本事琥珀散高剂量组按成人体质量的16倍剂量给药，本事琥珀散中剂量组按成人体质量的8倍剂量给药，本事琥珀散低剂量组按成人体质量的4倍剂量给药，西药组按成人体质量的8倍剂量给药。

1.2.2 模型制作 取雌性成熟未孕 SD大鼠，己烯雌酚灌胃统一动情期后，行造模手术。室温 23～28℃，无菌操作。以 10% 水合氯醛（0.4 mL/100 g） 腹腔注射麻醉大鼠，然后固定大鼠于鼠板，腹部备皮、常规消毒。在尿道口上端约1 cm处进入，沿腹中线向下切开1.5～2 cm，进入盆腹腔。找到大鼠子宫（呈 V形）后，结扎左侧子宫角局部血管以及需切除部分子宫的上下两端。于左侧子宫角上切取长约1 cm的部分，于PBS溶液中洗去血污，剪去脂肪组织，将子宫腔纵向剖开，切取约 5×5 mm大小的子宫片。将该子宫片的内膜面贴于右侧腹膜上，细丝线缝合四角，为防止组织粘连及取材时伤及异位组织，缝合处应尽量远离腹壁切口。于关腹前向腹腔滴入以 0.9%生理盐水溶解的氨苄青霉素 16万U/kg，进行消毒。然后逐层缝合关腹。于术后第1天开始给予氨苄青霉素16万U/kg肌肉注射，每日 1次，连续 5 d。

1.3 成模标准 手术 5周后取材开腹时，观察到移植物体积明显增大形成囊泡，呈圆形或椭圆形，囊泡内有透明、半透明或黏稠不透明的囊液，表面可有结缔组织覆盖及血管分布，质地柔软。用游标卡尺测量移植物体积，根据 Katsuki方法：体积（V） =长×宽×高，移植物体积 ≥8 mm3者，即为模型复制成功［2-3］。

1.4 指标检测 于手术后第6周，用10%的水合氯醛麻醉动物，开腹（尽量避开手术时子宫片种植的部位）后，腹主动脉采血，用ELISA法检测血清ICAM-1、MMP-9和VEGF水平。

1.5 统计学方法 实验数据以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析及 LSD检验。应用SPSS 16.0软件作统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

ELISA结果显示：本事琥珀散高剂量组（简称高剂量组）对EMs大鼠血清 ICAM-1、VEGF均有较为明显的作用。对于ICAM-1而言，高剂量组含量明显高于其他各组（P<0.01）。而对于 VEGF而言，高剂量组虽与除本事琥珀散中剂量组（简称中剂量组）外的其余各组均无明显差异，但较中剂量组有明显差异（P<0.05）。见表1~2。

表1 本事琥珀散对EMs大鼠血清ICAM-1的影响

表2 本事琥珀散对EMs大鼠血清VEGF的影响

在血清MMP-9表达中，正常组与其余各组之间均有明显差异（P<0.05，P<0.01），而伪手术组与各模型组大鼠均无明显差异。疾病模型组除与伪手术组和高剂量组没有明显差别外，与其余各组均差异明显（P<0.05，P<0.01）。高剂量组则与正常组、本事琥珀散低剂量组（简称低剂量组）和达那唑组存在明显差异（P<0.05，P<0.01）。见表3。

表3 本事琥珀散对EMs大鼠血清MMP-9的影响

3 讨论

在EMs发生发展过程中，“黏附（Attachment）-侵袭（Aggression）-血管生成（Angiogenesis）”三个基本环节，即“3A”模式是异位内膜种植生长和异位病灶形成的必经过程。“3A”模式中的每个环节都受到一系列细胞因子的影响，其中细胞间黏附分子（ICAM-1）使异位内膜顺利的附着于腹壁，基质金属蛋白酶（MMPs）帮助异位内膜降解细胞外基质，成功侵入盆腹腔内膜，以血管内皮生长因子（VEGF）为代表的促血管生成因子则实现了异位内膜的血液供养，从而完成了异位内膜种植成活、异位病灶形成的全过程。

3.1 黏附 进入盆腹腔的子宫内膜细胞必须先与盆腔黏膜或腹膜发生黏附，才可能成功的种植、浸润发展。因此，黏附是 EMs形成的首要环节。有研究表明，脱落的子宫内膜细胞24 h之内即可黏附于盆腔黏膜上，形成异位病灶［4］。ICAM是黏附环节代表性的细胞因子，其中最为重要的是 ICAM-1。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族，是一个分子量为 76~114 Kd的含有505个氨基酸的跨膜蛋白，由5个 Ig样功能区组成。正常情况下，ICAM-1很少表达或不表达，而在受到炎性细胞因子等刺激后则可表达于多种细胞表面，包括子宫内膜腺上皮和间质细胞［5］，介导细胞-细胞、细胞-基质间的黏附。在 EMs中，有研究发现，ICAM-1在 EMs患者的腹腔液和异位内膜中有高表达，而在患者在位内膜中呈低表达状态［6］，表明 EMs患者的子宫内膜稳定性与基底膜黏着性降低，而异位内膜与基底膜的黏着性增高，因而容易异位至盆腹腔内。

本课题研究结果表明，在EMs大鼠血清中，疾病模型组与正常组、伪手术组ICAM-1含量之间没有明显差异，说明异位病灶的形成并未影响到血清ICAM-1含量。本事琥珀散高剂量组血清ICAM-1含量明显高于其余各组，说明本事琥珀散能够升高血清ICAM-1含量。达那唑组亦对血清ICAM-1有升高趋势，说明达那唑对EMs的治疗作用可能与升高血清ICAM-1含量有关，由此可以推断本事琥珀散在黏附环节对EMs有治疗作用。在本事琥珀散高、中、低剂量组中存在ICAM-1逐渐升高的趋势，说明本事琥珀散对EMs大鼠血清ICAM-1含量的影响存在量效关系。

3.2 侵袭 异位内膜细胞黏附于盆腔黏膜间皮表面后，需要继续侵入细胞外基质和基底膜，才能在卵巢、盆腹腔等处种植生长。因此，细胞外基质和基底膜的降解与重建，在EMs发生发展过程中起着重要作用。MMPs是侵袭环节的主要代表，是降解细胞外基质最主要的一类蛋白水解酶，能够帮助异位内膜降解细胞外基质，成功侵入腹壁内膜。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的，属于明胶酶类，是细胞外基质重建的关键酶。MMP-9具有较强的蛋白水解能力，能够降解并破坏细胞外基质和基底膜，突破其屏障作用。并能促进血管内皮细胞的出芽，导致新生血管的形成，从而促进异位内膜的种植生长，并通过与整合素的相互活化，加强细胞间的黏附作用［7］，有利于EMs的发生，在异位内膜细胞的黏附、种植和生长过程中发挥了重要作用［8-9］。有研究表明，在正常子宫内膜中 MMP-9的含量较低，而在异位内膜中其表达水平则明显升高［10］。

本课题研究结果表明：在EMs大鼠血清中，正常组MMP-9含量明显高于其余各组，包括伪手术组，说明手术造模，即便是单纯开腹，亦会对外周血MMP-9含量造成影响，而减少的 MMP-9可能参与到了手术伤口的损伤修复过程中。疾病模型组 MMP-9含量与除伪手术组和高剂量组外的其余各组均有明显差异，说明疾病模型组血清MMP-9含量的降低主要是由于开腹造模所造成的，而与异位病灶的形成无关。本事琥珀散高剂量组并没能对造模后的血清 MMP-9含量产生明显影响。同时血清MMP-9含量随本事琥珀散给药浓度的增加而增加，说明本事琥珀散在增加血清MMP-9含量方面存在量效关系。

3.3 血管生成 异位内膜本身及其周围组织新的血供的建立，是维持异位内膜种植存活并生长的基本条件。因此，血管生成是 EMs发生发展的关键步骤。以血管内皮生长因子（VEGF）为代表的促血管生成因子实现了异位内膜的血液供养，从而完成了异位病灶种植成活的全过程。VEGF是最关键的血管生成因子，主要参与调控血管内皮细胞的增殖和血管的构建，对于新生血管形成、血管内皮细胞增殖迁移及微血管通透性均有促进作用。异位内膜的种植、成活都需要血液的供养，因此血管生成在异位内膜的生长和侵袭过程中具有重要意义。在 EMs中，VEGF呈高表达状态，无论是腹腔液或组织中，其升高程度亦与疾病严重程度相关，并呈周期性变化［11］。

本课题研究结果表明：在EMs大鼠血清中，VEGF含量在各组之间均没有明显差别，说明无论是手术造模还是给药治疗均不通过血清VEGF起作用。

总之，可以认为，自体内膜移植EMs大鼠模型手术造模和中西药治疗都没有明确的影响到外周血中“3A”模式各环节细胞因子的含量。而本事琥珀散基本存在能够升高血清ICAM-1和MMP-9含量的作用，并存在量效关系。由于本研究只针对“3A”模式各环节细胞因子含量在外周血中的变化，尚难以看出本事琥珀散对EMs的治疗作用。今后将进一步研究本事琥珀散对EMs大鼠在子宫内膜异位症中“3A”模式各环节细胞因子含量的变化，及其与血清细胞因子含量变化的关系，更深入的探讨本事琥珀散治疗EMs在“3A”模式中的作用机制和途径。

佩兰的临床注意事项

《中国高等植物图鉴》第四册将华泽兰Eupatorium chinense L.称为兰草，把佩兰 Eupatorium fortunei Trucz.别名称之为泽兰，而菊科泽兰Eupatorium japonicum Thunb.易和唇形科植物泽兰 Lycopus lucidusTurcz.var.hirtus Regel.在处方用名和入药品种相互混淆。

另，在商品流通——按佩兰入药的品种还有异叶泽兰 Eupatorium het-erophyllum DC.和尖佩兰 Eupatorium lindleyanum DC.

——摘自祝之友教授《神农本草经药物解读——从形味性效到临床（3）》，人民卫生出版社，2018.