细胞外基质蛋白模式对成肌细胞分化的影响

邱昌俊 浑婷婷 赵莹彤 詹悦维 赵 峰 孙 艳*

1(北京航空航天大学生物与医学工程学院，生物力学与力生物学教育部重点实验室，北京 100191)2(中国科学院上海微系统与信息技术研究所，传感技术联合国家重点实验室，上海 200050)

引言

体外条件下成肌细胞能否获平行排列是其分化成功能性肌管的关键[1-2]。已有研究表明，成肌细胞会以端对端的形式融合并形成线性的肌纤维，而细胞的侧向融合受到限制。但是，细胞的侧向相互作用和端对端作用都对细胞融合有影响，如果限制了侧向移动，细胞的融合将受到限制[3]。线性排列的成肌细胞比自由生长的成肌细胞的分化显著增加[4]。条带状的细胞排列不仅能使肌管排列方向得到类似于体内的平行排列，而且使成肌细胞的分化效率得到明显提高，包括抑制增殖、促进细胞退出分裂周期进入分化阶段、提高成肌细胞融合系数、延长肌管等特点[5-6]。然而，对于如何实现成肌细胞的最佳排列和分化仍然有许多问题亟待解决，细胞水平下的融合机制尚不清楚。

FN(Fibronectin)作为细胞外基质，能促进细胞的黏附、增殖、分化等过程[7-9]。微接触印刷技术则为研究细胞与细胞之间多方面的关系，提供了一个有效的实验方法[10]。利用微接触印刷技术，可以在基底上形成特定的FN微图案，从而进一步调控成肌细胞的排列，促使单核的成肌细胞按照预期情况互相识别、配对、粘连并融合，得到平行排布的多核肌纤维[11]。然而，成肌细胞融合与分化的内在机制尚不明确。

本实验通过设计不同类型极性排列的FN微图案，研究了不同极性排列的FN基底微图案对小鼠成肌分化、细胞微丝的分布和骨架重排以及细胞黏附的影响，为进一步探索如何实现二维微图案技术精密控制细胞排列充实了理论依据。

1 方法

1.1 材料和设备

PDMS Sylgard 184(Dow Corning)，DMEM高糖培养基(Corning)，胎牛血清(HyClone)，马血清(HyClone)，人纤维粘连蛋白(Corning，货号356008)，Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG(北京博奥森生物技术有限公司)，DAPI染色液(北京博奥森生物技术有限公司)，Monoclonal Anti-Vinculin Antibody(Invitrogen)，实验中所用其他试剂除特殊说明外，均购自美国Sigma公司；小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12，购自美国模式培养物寄存库ATCC(CRL-1772TM)。

激光直写光刻设备(Heidelberg Instruments)，脱泡搅拌机(Thinky)，台式匀胶机(中国科学院微电子所, 中国)，不锈钢电热板(金坛市天竟实验仪器厂，中国)，倒置荧光显微镜(Olympus，日本)。

1.2 实验过程

1.2.1蛋白微图案基底的制备

本实验使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性印章，并通过微接触印刷技术在PDMS薄膜上成功制备了蛋白(本实验为fibronectin, FN)微图案，图1所示为微接触印刷技术的操作流程。

图1 微接触印刷技术的操作流程Fig.1 The protocol of microcontact printing technique

首先，通过激光直写设备制备，具有微图案的光刻胶基底；然后，将PDMS前聚物与交联剂以10∶1的比例加入杯具，放入脱泡搅拌机中配平，并以2 000 r/min，混匀2 min，除泡2 min。在光刻胶基底上倒入适量的PDMS，并置于电热板上，以65℃固化12 h，再将固化后的PDMS剥离，切割出所需要的微图案印章。

对于PDMS薄膜的制备，先将直径为25 mm的玻璃基片进行超声清洗，用丙酮、75%乙醇、去离子水依次清洗5 min。干燥后，取适量PDMS滴在盖玻片上，以1 000 r/min预旋涂10 s，随后以4 000 r/min旋涂60 s，最终在玻璃基片上形成厚度为15 μm的PDMS薄膜，再将薄膜加热固化，其固化条件与PDMS印章制备相同。最后，通过微接触印刷技术将蛋白微图案转移到PDMS薄膜上，形成蛋白微图案。

1.2.2细胞在蛋白微图案基底上的黏附及分化

取生长状态良好的P5代C2C12成肌细胞，消化后计数。调整细胞浓度至5×104个/mL，将细胞接种到转印有蛋白的微图案基底上，置于5% CO2、37℃恒温培养箱内培养，分别在2、4、6、12、18 h利用荧光染色法观察细胞的铺展和黏附；调整细胞接种浓度至2×105个/mL，在5% CO2、37℃，置于恒温培养箱内培养48 h后，待细胞生长至90%以上开始融合时，将含10%胎牛血清的培养液更换为2%马血清的培养基诱导分化，持续培养7 d后，进行免疫荧光染色。

免疫荧光染色法步骤如下：37℃的PBS清洗细胞，弃去PBS溶液，再分别加入浓度为4%的多聚甲醛对细胞进行固定，浓度为0.01 M的PBS溶液清洗细胞3次，每次5 min。加入浓度为0.1%的Triton X-100溶液处理15 min，用1% BSA/PBS溶液封闭1 h。再分别用抗MHC和vinculin的抗体(1∶200)室温孵育1 h后， PBS清洗细胞3次，每次5 min。然后加对应的二抗(1∶100)、罗丹明标记的鬼笔环肽(1∶100)、DAPI(1∶1 000)，小心混匀。室温下避光孵育1 h。染色结束后，使用浓度为0.01 M的PBS洗细胞3次，每次5 min，并用倒置荧光显微镜观察细胞拍照记录。

1.2.3数据统计与分析

蛋白染色图像利用Image J软件几何参数测量，并对肌管形成数量进行了统计分析。每个实验重复3次，实验结果用均数±标准差表示。采用SPSS 13.0统计分析软件One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验。

细胞骨架图像利用Matlab软件，模拟分析肌动蛋白纤维丝矢量与整体微图案排列方向之间的夹角，并将微丝向量的分布频率绘制成直方图。

2 结果

2.1 微图案的设计与基底的制备

有研究表明，线性排列(条带状)的成肌细胞比自由生长的成肌细胞的分化显著增加[12]。当成肌细胞在面积为10 μm×200 μm的长方形微图案上培养时，分化的成肌细胞较多，而当成肌细胞在面积为2000 μm2的圆形微图案上培养时，分化的成肌细胞较少[13]。本课题组的前期实验证明：微图案宽度为10 μm的几何图案对于成肌细胞生长宽度太窄，20～50 μm更适合成肌细胞生长和分化[14]，因此选择40 μm宽度的微图案，更适合C2C12细胞融合形成肌管，且足够宽，能满足成肌细胞生长所需；同时足够窄，能有效的引导细胞在蛋白微图案上有序生长，迁移和融合[16-17]。

本实验一共设计了3种极性排列条带微图案和40 μm宽条带作为对照，微图案整体为条带状图案，如图2所示。微图案条带总宽度为40 μm，条带之间的间距为50 μm。各组微图案之间均为横向阵列排列，每组微图案面积均为36 mm2(6 mm×6 mm)。

图2 微图案的设计。(a)平行组(PG)，10 μm×40 μm；(b)随机组(RG)，10 μm×10 μm；(c)垂直组(VG)， 40 μm×10 μm；(d)对照组(CG)Fig.2 The designed polarity arrangement micropattern. (a) Parallel group(PG), 10 μm×40 μm；(b) Random group(RG), 10 μm×10 μm；(c) Vertical group(VG), 40 μm×10 μm；(d) Control group(CG)

极性排列微图案的具体参数如下：10 μm×40 μm的长方形，其极性方向平行于整体条带方向，即平行排列组，以下均简称为平行组(parallel group，PG)(见图2(a))；10 μm×10 μm的正方形，其极性方向平行与垂直概率各半，即随机排列组，以下均简称为随机组(random group,RG)(见图2(b))；40 μm×10 μm的长方形，其极性方向垂直于整体条带方向，即垂直排列组，以下均简称为垂直组(vertical group，VG)(见图2(c))；条带状无极性图案，即对照组(control group,CG)(见图2(d))。其中，极性图案之间的最小间隔均为5 μm。

将设计好的微图案通过激光直写光刻系统和微接触印刷技术，各组均获得了尺寸较为精确的光刻胶基底(见图3(a))和PDMS印章(见图3(b))。通过对FN蛋白微图案基底进行免疫荧光染色，观察到了所制备微图案外观为极性排列，微图案排列均匀、清晰完整。通过Image J对FN微图案免疫荧光染色图(见图3(c))进行了测量，测量参数及统计结果如表1所示。表1证明，制备获得的PDMS薄膜基底FN极性微图案尺寸与所设计的尺寸基本相符，满足实验需求。

图3 微图案基底制备荧光显微镜照片(每行从左到右依次为PG、RG、VG、CG)。 (a)光刻胶基底明场图(20×)；(b)PDMS印章明场图(40×)；(c)FN蛋白微图案荧光染色图(10×)Fig.3 FM photos of micropattern substrates(In each raw，the order from left to right is PG, RG, VG, CG). (a) Bright field image of micropattern on the photoresist stencil (20×); (b) PDMS stamp (40×)；(c) Immunofluorescence staining of FN micropattern on the PDMS film substrates (10×)

Tab.1ThestatisticsofdifferentFNmicropatternparametersbyfluorescencestainingn=10

2.2 FN极性对成肌细胞分化的影响

对不同极性微图案上的细胞进行诱导分化，免疫荧光染色法观察细胞的分化状态(见图4)。结果发现，对照组长条带微图案上的细胞在诱导7 d后，分化形成的肌管数最多，诱导分化效果最好(见图4(d)、图5)。

图4 成肌细胞极性排列诱导分化荧光染色图。 (a)平行组(PG)；(b)随机组(RG)；(c)垂直组(VG)；(d)对照组(CG)Fig.4 Immunofluorescence staining of C2C12 induced differentiation on different polarity arrangement FN micropattern. (a) Parallel group(PG)；(b) Random group(RG)；(c) Vertical group(VG)；(d) Control group(CG)

值得关注的是，极性排列的微图案上的细胞诱导分化7 d后，极性方向平行于整体条带组PG所形成的肌管数与对照组相比无显著性差异(个数分别为17.33±0.58、16±1.73)，极性方向平行于整体条带组PG上肌管形成个数明显高于垂直组VG和无极性组RG(见图5，分别为7±1、10.89±0.19)。

图5 不同极性微图案诱导分化肌管总数Fig.5 The myotubes numbers induced on different polarity micropattern

2.3 FN极性对成肌细胞微丝分布的影响

随着时间推移，成肌细胞逐渐在FN极性微图案上进行黏附和铺展，细胞骨架肌动蛋白微丝也会随时间出现规律性的变化。通过利用Matlab软件对所得的细胞骨架图像进行平滑处理，将细胞骨架在空间方位分布的频率以直方图的形式体现，如图6所示。

图6 不同时间点肌动蛋白纤维丝取向分布(每行从左到右依次为PG、RG、VG、CG)。(a) 2 h；(b) 6 h；(c) 12 hFig.6 Histogram of actin orientation angles of C2C12 cells at different time on the different FN micropattern substrate(In each raw，the order from left to right is PG, RG, VG, CG). (a) 2 h；(b) 6 h；(c) 12 h

对3个时间点(2、6、12 h)的微图案基底上的细胞骨架进行软件模拟分析，并对比了3个不同时间下成肌细胞在极性微图案上的细胞骨架微丝取向分布概率之间的规律。结果发现，成肌细胞在微图案上生长2 h后，从肌动蛋白纤维丝矢量图可以看出，不同极性排列微图案的微丝分布差异明显，微丝组装与局部微图案极性取向相同(见图6(a))，表明细胞微丝分布方向在2 h左右受FN局部微图案极性排列影响非常明显。在细胞培养6 h后(见图6(b))，肌动蛋白纤维丝矢量方向开始出现“适应性”改变，微丝分布开始逐渐沿整体条带图案长轴方向发生聚集；暗示细胞开始产生变形并逐渐开始脱离局部图案束缚，沿整体图案长轴方向铺展，细胞骨架发生重排。在细胞培养12 h后，几种图案上肌动蛋白纤维丝矢量都只沿整体图案长轴方向排列(见图6(c))，肌动蛋白纤维丝的矢量分布已无法观察到明显的组间差别。推测是由于此时细胞沿条带长轴方向铺展，细胞之间已经形成连接。

由此可知，微图案整体长轴方向决定了细胞骨架最终的空间方位和肌动蛋白微丝的分布，FN微图案极性排列方向，在细胞黏附早期会对细胞的微丝和骨架分布有明显影响。

2.4 FN极性对成肌细胞黏附的影响

待18 h后，细胞完全铺展，进一步通过对成肌细胞在不同极性FN微图案上黏着斑的形成区域和排列方向进行分析。

图7 C2C12细胞黏着斑免疫荧光染色图(100×，白箭头所指为黏着斑)。 (a)平行组；(b)随机组；(c)垂直组；(d)对照组 Fig.7 Immunofluorescence staining of adhesion plaque in C2C12. (100×，The white arrow in all of the image showed adhesion plaque). (a) Parallel group; (b) Random group; (c) Vertical group; (d) control group

结果发现，FN微图案极性排列会对成肌细胞黏着斑的形成产生影响，如图7所示。与对照组相比，极性微图案各组间细胞黏着会在微图案分布区域形成，并且黏着斑的分布与局部FN微图案排列一致，实验结果提示FN微图案可以控制黏着斑的分布。进一步分析黏着斑的排列方向，发现随机组和对照组黏着斑的排列方向较为分散、随机，而平行组和垂直组黏着斑的排列方向较为集中，且沿着长条带微图案整体方向分布。但是，与对照组相比，极性排列由于微图案的影响，各组间形成的黏着斑均被“打断”，无法形成连续的黏着斑。

3 讨论

在许多研究中，微图案化技术可以用来控制细胞的几何排列，控制细胞的取向在组织及器官的构建中具有重要意义。Toshinori等研究了在各向异性(正交)和各向同性(平行)的多层PLGA细胞培养板上的小鼠骨骼肌成肌细胞(C2C12)分化情况，发现空间的细胞取向会对细胞的分化、肌管的构建以及基因的表达产生影响[18]。Takayama等证实，在线性(条带状)微图案上形成的肌管表现出融合率增加，而线性微图案可增强肌管对外部电刺激的响应[19]。

Liu等通过研究发现，在微图案上的成肌细胞，其骨架肌动蛋白的排列方向会逐渐平行于整个图案排列的方向，而不是单一图案的方向[20]。这表明，细胞排列也是决定细胞生理学的一个重要因素，而这种复合微图案可以精确地控制细胞连接、细胞相互作用、细胞信号转导的多个细胞。Moraes等通过研究发现，可以通过适当设计微图案尺寸或者改变制造工艺条件来控制细胞在微图案上的形态，主要取决于微图案的宽度和密度[21]。

本实验通过设计3种类型不同长宽比(1∶4、4∶1、1∶1)极性排列线性微图案条带，通过与无极性排列的长条带微图案做比较，发现微图案极性影响小鼠成肌细胞的黏附和细胞骨架微丝蛋白F-actin 的重排过程。随时间变化，细胞黏附和铺展状态逐渐变好，细胞微丝蛋白会沿着整体图案的长轴方向形成聚集。同时，有极性的微图案对细胞的黏附会产生影响，无极性长条带上的细胞生长状态良好。这表明，通过合理控制微图案的极性排列，可以更精确地控制细胞骨架肌动蛋白微丝的分布。

本实验对18 h极性排列成肌细胞中的黏着斑进行染色，发现极性排列微图案对黏着斑的形成也会产生影响，由于FN微图案局部排列不同，其黏着斑的形成区域和排列方向也会有差别。这说明，通过设计不同排列的FN微图案，可以更好地控制细胞的黏附和形态。

在对极性排列微图案上进行小鼠成肌细胞诱导分化培养7 d后，免疫荧光染色的结果分析还表明，不同极性微图案上对管形成的数量会有不同程度的影响：条带微图案对照组分化效果最好，形成的肌管数量最多；其次是微图案极性方向平行于条带微图案长轴方向组，形成的肌管数量要明显高于微图案极性垂直于条带微图案长轴方向组和微图案极性取向随机组。分析认为，该结果可能是因为FN微图案的极性对成肌细胞黏附有一定的影响，从而导致了细胞在分化过程中的黏附和铺展效果的差异。这对进一步探索如何进行极性排列下的成肌细胞的分化，以及如何获得平行排列的分化肌管，提供理论依据。

综上所述，对细胞外基质蛋白FN的不同极性排列模式下成肌细胞分化的研究结果表明，微图案极性对小鼠成肌细胞分化过程会产生影响，主要体现在不同极性FN微图案上诱导分化7 d后，形成的肌管数目有显著性差异。进一步的研究表明，不同极性FN微图案上成肌细胞的骨架与黏着斑的分布和排列不同。微图案极性排列对小鼠成肌细胞黏附早期的骨架分布会有显著的影响，而在细胞黏附的中后期开始逐渐减弱，其微丝骨架会逐渐沿整体图案长轴方向产生聚集和重排，并且可以通过FN微图案控制成肌细胞黏着斑的形成区域和排列方向。

4 结论

当FN微图案极性方向平行于条带微图案长轴方向时，最有利于成肌细胞融合形成极性排列的肌管，这对于在二维水平上更好地控制成肌细胞的分化提供了理论指导。在不同极性微图案上，成肌细胞诱导分化形成肌管的能力不相同，其原因可能是由不同极性图案上细胞的黏附和铺展不同而引起。分子水平和蛋白水平的差异还有待于进一步研究。