肝脏病理性血管改建在肝纤维化中的作用

肝纤维化是由各种病因引起的肝脏慢性损伤的疤痕修复，主要表现为肝组织中细胞外基质沉积及假小叶形成。肝星状细胞(HSC)活化后的肌成纤维细胞是肝纤维化形成过程中细胞外基质(ECM)产生的关键细胞。目前已有大量关于HSC的激活及ECM过量堆积的机制研究报道。抑制HSC激活、促进胶原纤维的降解可改善多种动物模型的肝纤维化。此外，研究者还发现肝脏的慢性炎性反应推动着肝纤维化的进展，持续的肝脏炎性反应与肝硬化的发生密切相关。在对抗肝脏胶原纤维沉积的过程中，减轻肝脏的炎性反应对肝纤维化的逆转也大有裨益。但是，迄今为止尚无药物被临床确认具有肯定的抗肝纤维化疗效，并实际应用于肝纤维化患者的临床治疗。肝纤维化治疗的瓶颈除了人类肝脏疾病目前尚不能用体内外模型来完全模拟以外，没有从肝病的整体上考虑肝脏结构的改建是一个关键因素。

肝脏纤维化过程中的血管改建已经得到越来越多的关注。病理性的血管增生与肝纤维化密切相关，推动着肝纤维化的发展，最终进展至肝硬化或肝细胞癌。本文将从肝窦内皮细胞(LSEC)毛细血管化、肝脏病理性血管增生及肝内血液分流这3个方面讨论肝纤维化过程中的肝脏血管改建。

1 LSEC毛细血管化

LSEC是被覆于肝窦内的一类特殊、扁平、狭长的血管内皮细胞，占肝脏非实质细胞总数的40%。LSEC细胞膜上有许多窗孔，部分窗孔聚集成筛板样结构。人LSEC窗孔直径为100～200 nm。不同物种间LSEC窗孔的密度及直径不同，其中大、小鼠与人类的较为接近[1]。LSEC这种独特的结构有利于肝细胞从肝窦中摄取营养物质及排出分泌物；同时其窗孔结构还可发挥筛选屏障作用。乳糜微粒代谢的第1步是在肝窦中，LSEC表面的蛋白脂酶分解其中的三酰甘油；然后直径在100 nm左右的、不含大分子三酰甘油但胆固醇含量丰富的乳糜微粒残留物可以迅速通过内皮窗孔进入Disse间隙，而直径>500 nm的乳糜微粒则滞留在肝窦中[2]。

发生肝纤维化时，LSEC出现连续性细胞基底膜，并伴有窗孔消失，HSC活化，这些改变统称为“肝窦毛细血管化”。研究发现，LSEC在HSC的活化和肝纤维化进程中具有重要的作用，正常分化的LSEC能够促使活化的HSC逆转至非激活状态，有效防止肝纤维化的发展[3]。随着LSEC细胞窗孔消失及基底膜的形成，肝窦血液滤过的功能、肝细胞获取营养物质及氧气的摄取均受到影响。此外，有多项研究阐明了在生理、病理条件下影响LSEC窗孔的因素。多种激素、化学毒物、细胞外基质组分、低氧刺激、肝炎病毒及细胞因子可以影响LSEC窗孔的密度及直径[1]。免疫电镜发现LSEC窗孔周围环绕肌动蛋白微丝，表明细胞骨架结构在窗孔调节中具有重要作用。这一发现也为调节细胞内钙离子-钙调蛋白-肌球蛋白系统的药物和激素可调控LSEC窗孔大小提供了理论依据。另有研究发现，LSEC核周有海绵样、三维结构样窗孔发生区，在刺激因素作用下可移至胞质区形成窗孔样结构[4]。利用三维结构显微镜发现LSEC有略微突出于质膜表面的富含鞘脂和胆固醇脂的脂筏结构，多聚集于核周。这些脂筏铆钉于细胞骨架结构，共同维持细胞的稳定状态[5]。

血管内皮生长因子(VEGF)是维持LSEC正常分化状态的重要因素。VEGF通过一氧化氮(NO)依赖的和NO非依赖的途径维持LSEC的分化状态[3]。LSEC表达Hedgehog信号通路的受体及配体，当LSEC发生毛细血管化时，Hedgehog信号通路相关基因表达明显升高[6]。HSC分泌的骨成型蛋白9(BMP9)对于维持LSEC的正常分化状态具有重要作用，BMP9敲除的小鼠出现LSEC自发毛细血管化、肝脏炎性反应及纤维化[7]。他汀类药物可以改善肝硬化及门脉高压的主要原因是其可以诱导Kruppel样因子2(KLF2)的高表达。LSEC高表达KLF2可以促进内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达，发挥血管保护作用，同时NO-可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)介导的旁分泌可以抑制HSC的激活[8]。高表达KLF2的HSC通过诱导自身NF-E2相关因子2(Nrf2)的表达，可以降低其氧化应激，减少自身的激活；同时VEGF表达升高可保护LSEC，维持其正常分化状态[9]。肝X 受体(LXR)是属于配体激活的转录因子家族的核受体。在四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化模型中LSEC LXRα表达明显升高；当敲除LSEC LXRα后，CCl4诱导的小鼠肝损伤及肝纤维化程度均加重，LSEC毛细血管化也更严重[10]。另有研究表明，Notch信号通路在LSEC毛细血管化中也发挥重要作用。LSEC过表达Notch-1细胞内片段后，CCl4诱导的小鼠肝纤维化更严重，毛细血管化相关分子的表达也升高[11]。

2 肝脏病理性血管增生

肝脏血管增生可以是生理性的(如大部分肝切除)或病理性的(如缺氧、慢性肝炎、肝细胞癌等)。慢性肝炎过程中的病理性血管增生是一个多细胞、多因子参与的复杂过程。病理性血管增生推动了肝纤维化的进展，与肝纤维化的程度呈正相关。已有研究表明，肝纤维化过程中血管新生可引起胶原纤维改建，改建的胶原纤维产生的机械张力可促进HSC激活[12]。病理性肝脏血管增生与肝脏纤维组织沉积的类型也密切相关[13]。胆源性肝纤维化由于胆管反应及胆管周围肌成纤维细胞的增殖，纤维组织连通相邻的汇管区，包绕原有的肝小叶；至肝硬化阶段才出现纤维组织连通中央静脉及汇管区。慢性病毒性肝炎引起的肝纤维化由于桥接性坏死及界面性肝炎，纤维组织不仅连通相邻的汇管区，而且连通中央静脉及汇管区。慢性心衰引起的肝纤维化由于静脉流出道梗阻，纤维间隔连通邻近的中央静脉形成反向的肝小叶。酒精性、非酒精性脂肪性肝病及代谢性肝病的纤维组织常沉积于肝窦及肝细胞周围。在桥接性坏死及坏死后肝纤维化组织中病理性血管增生也较明显。

与正常肝组织相比，乙型肝炎病毒(HBV)与丙型肝炎病毒(HCV)相关肝硬化患者的肝组织血管密度明显增加；血管分子标志物CD31、VE-cadherin及CD34在肝窦的表达明显升高，尤其是在汇管区周围[14-16]。在非酒精性脂肪性肝病患者中，CD31阳性的新生血管常与纤维间隔并行，并且与肝脏纤维化程度呈正比[17]。通过对肥胖患者肝穿刺样本的研究发现，肝脏血管增生在非酒精性脂肪性肝病早期即可出现，甚至在肝脏脂肪变性时即有发生。促进血管增生的因子VEGF-A及其受体FLK-1的表达与脂肪性肝炎的严重程度并不相关，但与肝纤维化的程度呈正相关[18]。在肝纤维化纤维间隔形成过程中，汇管区至汇管区、小叶中央区至小叶中央区纤维间隔的形成改变了肝脏原有的小叶结构，但其中血管的生成对肝脏的影响较小，较为关键的是汇管区至小叶中央区纤维间隔新生血管的形成。一旦这些血管生成，正常流经肝窦的血液将由于血流压力梯度的作用，直接绕过肝窦由小叶间动脉及小叶间静脉进入中央静脉，途经的小叶实质随之缺乏营养供给。没有血液供应的肝小叶将逐渐坏死，最终导致整个肝脏的功能衰竭。

3 肝脏病理性血管增生的机制

肝脏血管增生与其他组织或器官的血管增生类似；但肝纤维化过程中的病理性血管增生受到肝脏特异性环境的影响，涉及肝脏中的非血管内皮细胞及非典型的促血管生成因子。此外，肝脏含有被覆大血管的连续型内皮细胞及覆盖肝血窦的、具有窗孔的LSEC这两种不同的血管内皮细胞，使肝脏的血管增生机制较为复杂。

逐渐加重的组织缺氧是引起肝脏病理性血管增生的关键因素。不论是在胆管结扎、二乙基亚硝胺、CCl4诱导的肝纤维化动物模型中，还是在非酒精性脂肪性肝病相关肝纤维化动物模型中，在肝组织缺氧的区域中VEGF的表达均明显升高，VEGF的表达水平与肝纤维化严重程度呈显著正相关[19]。在低氧环境下激活的HSC可高表达VEGF、血管生成素-1(Ang-1)及其受体VEGFR-2、Tie-2[20]。除缺氧引起的血管增生之外，在慢性肝脏损伤的创伤修复过程中伴随的多种生长因子(纤维母细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子β)、金属蛋白酶等的升高在肝脏血管增生中也发挥重要作用，这些因素相互配合，共同促进血管生成[21]。

Apelin是肝脏特有的促进血管生成的信号。Apelin在肝硬化患者及肝硬化动物模型血清中的表达明显升高，在肝纤维化组织中主要表达于纤维间隔及汇管区的HSC[22-23]。Apelin 受体(AGTRL1)在肝硬化组织中既表达于肝脏结节周边的肝脏纤维间隔，也表达于结节内的肝窦区域。阻断AGTRL1后大鼠肝硬化得到改善，同时肝脏血管密度降低。在大鼠肝纤维化模型中HSC的瘦素受体表达升高，瘦素信号激活促进HSC分泌VEGF及Ang-1，在肝纤维化病理性血管增生中发挥重要作用[24]。瘦素受体变异的大鼠与正常大鼠相比，饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎及氧化应激并无差异，但只有正常小鼠出现了肝纤维化及肝细胞癌，并且肝脏血管增生明显[17]。以上研究表明瘦素介导的血管增生是非酒精性脂肪性肝病进展至肝纤维化(和肝细胞癌)的先决条件。

HSC在肝脏血管生成中的作用主要取决于其表达的ephrin-B2受体。它与LSEC来源的血小板衍生生长因子(PDGF)结合后激活的信号可以促进LSEC形成新的血管，并且可增强HSC对LSEC的覆盖，在提高肝窦阻力中也发挥重要作用[25]。激活的库普弗细胞可释放一系列细胞因子、活性氧类物质、血小板激活因子(PAF)等[26]。PAF可促进核因子-κB(NF-κB)依赖的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1、成纤维细胞生长因子及VEGF的表达，促进人脐静脉内皮细胞生成血管[27]。库普弗细胞中TNF-α表达升高后，可以激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路，在细胞迁移、蛋白酶诱导、细胞凋亡及血管增生中均具有重要作用。同时，肝脏活性氧类物质增加后TNF-α、NO、低氧诱导因子-1 (HIF-1)及VEGF等一系列促进血管增生的因子均表达升高[28]。

4 肝脏病理性血管增生的治疗

肝脏病理性血管增生的治疗方法主要是干预促进肝脏血管增生的主要信号通路。利用VEGFR-2单克隆抗体或者激酶抑制剂SU5416阻断VEGF信号通路后，可以明显减少大鼠肝纤维化过程中门-体静脉分流[29-30]。多靶向的受体络氨酸激酶抑制剂——舒尼替尼可以降低肝硬化大鼠肝脏的炎性细胞浸润、纤维化程度、血管密度及门脉高压[31]。应用VEGFR-2及 PDGFR-β阻滞剂(索拉非尼)治疗2周可以有效抑制胆管结扎所致肝纤维化大鼠肝脏的VEGF、PDGF及Raf信号，同时减少近80%的脾脏新生血管，降低内脏和全身高动力循环，减少肝脏18%的门-体静脉分流，降低25%的门静脉压力，最终改善大鼠肝纤维化程度[32]。但另有研究表明，利用索拉非尼抑制肝脏血管增生在纤维化早期有利于纤维化缓解，在纤维化晚期则会加速肝硬化的进展[12]。有研究表明，利用胎盘生长因子(PLGF)基因敲除的小鼠诱导肝纤维化模型，其肝脏新生血管、炎性反应、纤维化及门脉高压均降低[33]。PLGF抑制不会影响健康血管的结构，是干预病理性血管增生的又一项选择。

一些非典型的血管增生因子也被用来作为抑制肝脏病理性血管增生的靶点。大麻素受体-2激动剂可以改善胆管结扎及CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝内门-体静脉分流、血管增生及纤维化[34-35]。抑制Apelin信号可以改善CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏胶原纤维沉积、血管增生及门静脉高压[35]。CXCR3基因敲除的小鼠经CCl4诱导肝纤维化后，肝脏VEGF表达升高，血管密度及纤维化程度明显高于野生型小鼠；应用CXCL9则可以缓解CCl4诱导的野生型小鼠的肝纤维化，抑制VEGF介导的内皮细胞的增殖及迁移，抑制肝脏血管增生[36]。另有研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂——拉格唑拉也可改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化。拉格唑拉不仅可以降低 TGF-β受体2的表达，抑制HSC激活，诱导HSC凋亡，同时还可抑制VEGF及其受体的表达，抑制肝脏血管增生[37]。

5 展望

综上所述，炎性细胞浸润可促进肝纤维化进展，炎性反应过程中激活的基质金属蛋白酶可促进胶原纤维溶解。血管增生可推动肝纤维化的进展，抑制血管增生对于缓解肝纤维化具有积极作用。因此，只有认识到肝纤维化病理生理过程的复杂性，应用辩证的思路看待肝纤维过程中细胞外基质沉积、炎性反应及血管改建，才能真正认清肝纤维化。