微生物组学在哮喘中的研究进展

旷健 黄榕 刘沉涛

中南大学湘雅医院儿科,长沙410008

目前已知,大量的微生物定居在人体的皮肤和黏膜表面,从宿主或其他微生物汲取赖以生存所需要的营养,高度适用于人体的复杂结构。微生物组学指寄居在人体内的微生物种类及其基因和基因组的总和。不同个体、不同躯体部位和不同时间的微生物组学组成均不相同[1]。黏膜免疫细胞和分子与人体暴露的细菌之间形成错综复杂的网络,精确调节组织中免疫耐受和炎症之间的平衡。生命早期形成的微生物群在宿主的成长和免疫系统发育中起重要作用[2],延迟或被改变的这些微生物群将增加过敏和哮喘发病的风险。本文着重综述微生物组学在肺部免疫调节中的可能机制,肠道和呼吸道微生物群改变在哮喘发病中的作用。

1 微生物组学作用的免疫机制

目前已知细菌通过多种机制参与诱导免疫耐受和抑制炎症。微生物群的细胞壁成分和代谢产物都参与调节宿主对微生物和环境刺激的免疫反应。部分共生菌如双歧杆菌、乳酸杆菌、梭状芽胞杆菌增加小鼠调节性T 细胞比例[4-5]。其中,梭状芽胞杆菌通过刺激ILC3产生IL-22,有助于加强内皮屏障功能,降低腹泻时小肠黏膜的通透性[6]。大肠杆菌和乳酸杆菌通过刺激树突状细胞中维生素A、色氨酸和血红素加氧酶1代谢,来促进诱导调节性T 细胞[7-8]。来源于脆弱类拟杆菌的荚膜多糖抗原A 通过直接作用于类浆细胞,从而促进CD4+T 细胞分泌IL-10[9]。来源于长双歧杆菌的表面多糖可抑制肠道和肺部Th17反应[10]。摄入外源性长双歧杆菌后,健康志愿者周围血中Foxp3+T 细胞增加,牛皮癣、溃疡性结肠炎患者血清前炎症因子CRP水平降低[11]。此外,肠道微生物代谢物短链脂肪酸,如醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐,可通过G 蛋白耦联受体结合,抑制组氨酸去乙酰化酶,促进树突状细胞和T 细胞反应[12]。人肠道细菌产生的大量生物胺影响机体的免疫反应和炎症反应[13]。在小鼠模型中,微生物产生的精胺、组胺和牛磺酸可激活宿主NLRP6 炎症小体信号通路,促进内皮细胞分泌IL-18,并促进下游的抗微生物多肽分泌[14]。

2 微生物组学在哮喘模型中的研究

多个不同的动物研究支持微生物组学在气道疾病发病中的作用。在不暴露于任何病理或非病理微生物的无菌(germ free,GF)动物中发现,微生物群有助于降低过敏性气道炎症。Herbst 等观察到,卵蛋白 (ovalbumin,OVA)激发后,GF小鼠中的2型气道炎症和气道高反应明显强于共生微生物定植的无特定病原体 (specific pathogen free,SPF)小鼠。将GF小鼠与清洁小鼠共同饲养3周后,GF小鼠的2型气道炎症和气道高反应降至清洁小鼠水平,提示肠道和气道共生菌具有保护作用[15]。此外,生命早期共生菌定居的GF 小鼠肠黏膜固有层和肺内的自然杀伤细胞减少,从而减少了过敏性气道反应的严重程度;然而生命早期之后定植菌对疾病表型没有影响,也不影响调节性T 细胞或自然杀伤T 细胞的发育[16]。此外,重建肠道微生态社区有益于防治由于新生小鼠的抗生素治疗导致的调节性T 细胞减少和Th细胞2型反应增强[17-18]。

Gollwitzer等模拟婴儿气道微生物定植条件下,研究了不同年龄 (3、15、60 d)的小鼠对屋尘螨 (house dust mites,HDM)诱发的过敏性气道炎症的敏感性。结果发现：暴露于HDM 后,新生小鼠较年长小鼠易诱发气道嗜酸粒细胞增多,2型细胞因子释放增加,并表现出较高的气道高反应性。年长小鼠的这种保护作用与小鼠肺组织定植的细菌数量和GAMMA-变形杆菌和厚壁菌向拟杆菌优势转移有关。这项研究表明,小鼠体内在生命早期缺乏特定的细菌种类将影响之后免疫调节机制的形成,并使机体免疫平衡漂移至过敏而不是免疫耐受[19]。小鼠口服补充特定微生物如双歧杆菌、Clostridium cladeⅣ和ⅩⅣ,或荚膜多糖PSA 脆弱拟杆菌后,通过诱导调节性T 细胞相关IL-10分泌的抗炎反应,减轻过敏性气道炎症[20]。除了肠源性调节性T 细胞迁移到肺部后产生抗炎作用外,微生物群产生的代谢物直接影响肺免疫应答[21]。高纤维饮食增加了大肠杆菌和放线菌的种类,并减少厚壁菌和变形杆菌,由此抑制小鼠过敏性气道炎症[22]。微生物对Dtryptophan、维生素A,或生物胺代谢的作用还可调节肺内Th细胞介导的2型变态反应[23-24]。多项研究表明,小鼠呼吸道直接暴露在微生物产物如内毒素或含Cp G 的寡核苷酸将抑制经典特征哮喘发病[25-26]。例如,鼻内大肠杆菌暴露将保护OVA 致过敏性气道炎症小鼠模型[27]。Suijs等[28]证明长时间暴露低剂量内毒素或农场灰尘可保护HDM 诱导A20小鼠哮喘。

3 肠道微生物在哮喘中的作用

肠道微生物群是人体最大细菌集落,由含有超过800万个基因的500～1 000个不同的细菌菌种组成,并影响宿主免疫系统[29]。在3岁时,儿童肠道微生物群的组成达到成年人水平。欧洲的成年人肠道菌群优势菌群主要包括拟杆菌、厚壁菌、放线杆菌、变形杆菌等,胃、十二指肠、近端小肠优势菌群还包括链球菌、厌氧菌,双歧杆菌[30]。肠道微生物群可通过多种机制影响远距离部位 (如肺)的免疫应答：与健康志愿者比较,哮喘患者肠道分泌组胺的细菌数增加[31],组胺通过作用于组胺2 受体保护肺组织[32]。生命早期肠道微生物群受许多环境因素影响,如生活在微生物丰富的环境 (例如农场、频繁接触家畜和宠物、或多样化的饮食)中与儿童哮喘呈负相关[33-36]。婴儿分娩方式显著影响细菌定植,剖腹产婴儿肠道通常定植更多的葡萄球菌属,杆菌科目 (Bacillales),丙酸杆菌科,棒状杆菌科,而较少定植不动放线杆菌属;经阴道分娩婴儿的肠道定植梭状芽胞杆菌增加[37]。除外分娩方式和饮食,母体妊娠期使用的抗生素或生命早期抗生素治疗持久地影响微生物群,如减少放线菌,增加拟杆菌和变形杆菌[1]。

多项研究发现生命早期肠道菌群失调增加哮喘发病风险。出生后1个月内定植的艰难梭菌与年龄在6～7岁前儿童喘息和6～7 岁哮喘患病有关[38]。与非哮喘儿童相比,发生哮喘学龄期儿童在出生1周或1个月时肠道菌群多样性降低,但是与出生后1 岁时肠道菌群多样性无明显相关[39]。此外,肠道菌群中相对低丰度双歧杆菌、阿克曼菌属和粪杆菌属,而相对高丰度特殊真菌 (假丝酵母)的新生儿,发生过敏或哮喘的风险增高。因此,生命早期肠微生物失调与增加哮喘发病风险有关[40]。然而,目前尚不清楚肠道内的微生物失调是否可以直接驱动哮喘发病,或者肠道微生物失调通过改变免疫应答模式促进哮喘发病。

4 呼吸道微生物在哮喘中的作用

由于既往认为健康人气道组织是无菌的,所以在2007年启动人类微生物计划之初,研究者们未收集气道组织标本[41]。然而,不久之后一些研究者和研究团队的报道：健康人呼吸道微生物群的组成,及呼吸道微生物群在呼吸道疾病发病中的重要作用[42-44]。目前公认,健康呼吸道黏膜中含有众多细菌菌群[45],其中,上呼吸道中细菌密度最高,鼻腔和鼻咽部每鼻拭子可达到103～106个活菌。健康人气管和肺内采集的支气管肺泡灌洗中估计细菌数量约有102个细菌/ml[45-46]。呼吸道中常见的6种优势类菌群为厚壁菌、变形杆菌属、拟杆菌属、梭杆菌、嗜酸杆菌和放线杆菌[47]。Helty等[42]研究表明,哮喘和COPD 成人患者的上气道,以及儿童哮喘下气道中变形杆菌,尤其是嗜血杆菌占优势。Huang等[43,48]报道：症状控制4周后,采用吸入氟替卡松治疗的哮喘患者气道微生物多样性与支气管高反应性呈正相关。此外,与轻中度哮喘患者相比,重症哮喘患者气道中克雷伯氏菌丰度增高,变形杆菌与Th17 相关基因在气道上皮中的表达呈正相关,肥胖型哮喘患者急性加重时,痰中杆菌类/厚壁菌属更为丰富。然而,放线菌与哮喘控制无明显相关[49-50]。严重哮喘患者还与长期携带肺炎支原体和衣原体密切相关,为此目前欧美国家开展了多个临床试验来探讨大环内酯类抗生素在这组患者中的应用[51],但是研究得到的结果尚存在争议,需要进一步临床试验。

气道微生物在生命早期迅速增长,并且在之后的生命进程中受环境、健康状况和年龄的影响。已经证明,出生方式 (经阴道分娩或剖腹产)、在生后的第1 小时生活环境,和出生后3～4个月的生活环境暴露是呼吸和肠道菌群塑造稳定发展的至关重要阶段[52-54]。人体与动物研究表明：吸入携带微生物和微生物因子的尘埃粒子,通过调节先天免疫和适应性免疫反应,参与哮喘的发生、发展[28,55],但具体机制不清楚。目前儿童呼吸道微生物组学的研究工作主要集中于： (1)微生物如何在健康婴儿上呼吸道定植?(2)环境因素,如母乳喂养、生活在农场、兄弟姐妹、日托、宠物家庭、吸烟和抗生素使用对呼吸道微生物群的影响? (3)早期呼吸道微生物定植伴随着急性呼吸道感染的发生,如呼吸道合胞病毒、鼻病毒和流感病毒,是否参与哮喘发病的作用机制[56-58]? Teo等[53]进行前瞻性队列研究儿童自出生至2岁不同时间点鼻咽部微生物群菌群。这个队列中的健康婴儿在出生后2个月龄时最初被定植葡萄球菌或棒状杆菌属,随后稳定定居异球菌或莫拉菌属;而链球菌,莫拉菌或嗜血杆菌定植与出生后60周内病毒相关的急性呼吸道感染相关。另一项研究报道,在出生后4周龄时呼吸道定植肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌的婴儿,将增加5岁时哮喘发病风险[44,59]。此外,上呼吸道定植葡萄球菌属和莫拉菌属的健康婴儿在出生后2年内呼吸道感染率较低[52,59-60]。有趣的是,尽管生活在传统农场的阿米什儿童和工业化程度较高农场的哈特族儿童具有相似遗传性,生活在传统农场的阿米什儿童中哮喘和过敏性疾病的患病率很低,而来自工业化程度较高农场的哈特族儿童哮喘和过敏性疾病的患病率较高。研究者发现,阿米什住宅环境灰尘中的微生物和内毒素负荷较高[55],由此推测气道微生物多样性与HDM 过敏呈反比[61-62]。但是,目前还不知道是否粉尘相关微生物群的保护作用是由于多种细菌吸入和进一步呼吸道定植的作用,或者是吸入细菌代谢物的作用。

5 前景展望

目前,尽管已知微生物群显著影响宿主免疫系统成熟和免疫活性,但是这些免疫调节机制的分子基础才刚刚开始阐明。尚不清楚：气道微生物失调是否直接导致哮喘发病,抑或者仅仅参与肺内免疫反应;新型细菌菌株及其组分的鉴定,和细菌调节黏膜免疫机制等。儿童前瞻性出生队列与横断面研究提高了我们对健康儿童或患病儿童的气道或者消化道中保护性细菌定植时间窗的认识。然而,需要进一步的作用机制和流行病调查研究来揭示不同细菌菌株、宿主、过敏原和病毒之间的复杂联系。健康成人、哮喘患者和其他慢性病患者之间的气道微生物群差异已经进行了深入的研究。部分研究展现了哮喘患者的临床特征和呼吸道微生物差异表型。然而,为了了解哮喘患者疾病表型和内型,哮喘易感性和疾病进展之间的联系,仍需要大样本、多中心的纵向和前瞻性分析。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突