心肌细胞直接重编程研究进展

心血管疾病的典型特征是心肌细胞丢失、胶原沉积以及瘢痕形成[1]。Ieda等[2]首次提出转录因子Gata4、Mef2c和TBx5(GMT)可以将小鼠的心脏成纤维细胞在体外直接重编程为心肌样细胞，随后有很多研究利用转录因子、微小RNA(miRNA)及小分子来提高心肌细胞直接重编程的效率。但是，这些方法都是通过将逆转录病毒或慢病毒整合到基因组中来实现成纤维细胞向心肌样细胞的直接转化，这有可能会引起基因突变和表达中断等风险，使重编程效率降低。因此，有学者提出用非整合型病毒载体转染进行心肌细胞直接重编程，以弥补之前研究的不足。

1 整合型病毒载体直接重编程

1.1 体外直接重编程

Ieda等[2]利用GMT进行的重编程虽然效率低下，但是为后来的心肌细胞直接重编程研究奠定了基础。Song等[3]发现在GMT的基础上加入转录因子Hand2(GHMT)也可以将小鼠的心脏成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。在成年小鼠的鼠尾成纤维细胞中，GHMT可诱导9.2% (5.2%～19.7%)的心肌样细胞同时表达心肌重链蛋白启动子驱动绿色荧光蛋白(αMHC-GFP)和心脏肌钙蛋白 T (cTnT)，而GMT仅能诱导2.9%(1.5%～5.6%)的心肌样细胞同时表达aMHC-GFP和cTnT。在成年小鼠的心脏成纤维细胞中，用GHMT转染可以使7.5%的心肌样细胞同时表达aMHC-GFP和cTnT，而用GMT转染仅有1.4%的心肌样细胞表达aMHC-GFP和cTnT。转染1个月后，GHMT就可诱导成年小鼠的心脏成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞直接重编程为有自发性跳动的心肌样细胞，而且这些细胞具有钙离子瞬变和电活动特性，这提示加入Hand2可以提高心肌细胞直接重编程的效率。此后，有研究将更多的转录因子加入GMT以提高心肌细胞直接重编程的效率。Addis等[4]发现在GHMT的基础上加入转录因子Nkx2.5(HNGMT)可以高效地将小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠的心脏成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。在小鼠胚胎成纤维细胞中，HNGMT的效率比单用GMT高出50倍，而且诱导的心肌样细胞可以表达更多的心脏标记物，具有钙瞬变特性，可以长时间维持自发性跳动。

Protze等[5]发现使用慢病毒转染Tbx5、Mef2c和Myocd(3F-Myocd)可以将小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。与GMT相比，3F-Myocd诱导的心肌样细胞可以表达更多的心脏标记物，这提示Gata4可能并不是心肌细胞直接重编程所必须的核心转录因子。Mathison等[6]也证实了单独使用Gata4确实不能诱导产生心肌样细胞，但是单独用慢病毒转染Gata4可以显著减小心肌梗死后纤维化面积，从而改善心功能。

Zhou 等[7]发现Bmi1是心肌细胞直接重编程早期主要的表观遗传障碍，通过短发夹RNA(shRNA)抑制Bmi1可以提高组蛋白第三亚基4号赖氨酸的三甲基化(H3K4me3)水平，同时抑制心脏位点上的组蛋白H2A在赖氨酸119(H2AK119ub)的单链化，从而显著提高GMT的直接重编程效率。该研究还发现抑制Bmi1可以使内源性转录因子Gata4增多，从而减少了直接重编程过程中外源性Gata4的加入。这证明去除某些表观遗传障碍后，使用较少的转录因子就可以促进心肌细胞的直接重编程。通过shRNA调控表观遗传来提高重编程效率是心肌细胞直接重编程的重要进展，提示其他分子也可能通过调控表观遗传机制促进心肌细胞直接重编程。

Abad等[8]证实在GHMT的基础上加入经典的Notch抑制剂DAPT可以促进小鼠胚胎成纤维细胞向心肌样细胞转化。与GHMT相比，DAPT的加入使有肌节结构的细胞数量增加了5倍，在第25天时自发跳动的心肌样细胞数量增加了6倍，具有钙瞬变特性的细胞数量也显著增加。在此基础上加入丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)可以使高达70%的心肌样细胞表达cTnT。更重要的是，在第18天时45%的心肌样细胞即可发生自发性跳动。该研究还发现，DAPT可通过激活与转录因子Mef2c连接的心脏相关基因(Myh6、Tnnt2、Actc2)，提高心肌细胞直接重编程的效率。

Guo等[9]通过化学筛选的方法发现IMAP(胰岛素样生长因子-1、MII1抑制剂MM589、转化生长因子-β抑制剂A83-01和Bmi1抑制剂PTC-209)的协调作用可以提高心肌细胞直接重编程效率，它们通过抑制特定的C-C趋化因子信号通路[C-C基序趋化因子配体(CCL)3、CCL6、CCL17]和增加转录因子Gata4、Mef2c、TBx5的表达，提高心肌细胞直接重编程效率。

1.2 体内直接重编程

Qian等[10]首次证实了用逆转录病毒GMT可以诱导小鼠的心脏成纤维细胞在体内直接重编程为心肌样细胞。在体内，心肌样细胞形成了肌节结构，可产生动作电位，还可以对电刺激产生收缩反应。GMT转染后的第8周和第12周，超声心动图检查发现心脏的射血分数、心搏出量和心输出量均增加，而心肌梗死的面积减小。Song等[3]进一步证实了用逆转录病毒GHMT可以将小鼠心脏成纤维细胞在体内直接重编程为心肌样细胞。超声心动图检查发现GHMT转染后的第6周小鼠的心功能就开始改善，GHMT比GMT能更有效地改善心功能。Zhang等[11]后来也证实，加入转录因子Hand2可显著改善心肌样细胞的结构和功能，同时心脏的4种转录因子GHMT在心肌样细胞的肌节结构和收缩特性的形成过程中至关重要，这4种转录因子中没有一种转录因子可以独立地将成纤维细胞直接重新编程成为心肌样细胞。

Mathison等[12]发现用慢病毒多顺反子GMT转染可以促进小鼠体内外心肌细胞直接重编程。蛋白质印迹分析显示三联体(多顺反子GMT)和单体(单顺反子Gata4、Mef2c、Tbx5)载体产生了等同的GMT转基因表达，而荧光激活细胞分选(FACS)显示三联体载体直接重编程的能力大约是是单体载体的2倍。此外，与3个单独的单顺反子载体(EF=7%～13%)相比，单个多顺反子GMT载体(EF=10%～37%)可以显著改善小鼠的心功能。多顺反子载体可以通过单个病毒载体诱导心肌样细胞形成来提高心肌细胞直接重编程效率，而不需要每个单顺反子载体的3次分别转染，这就减少了转染的次数，从而降低了多次转染产生的免疫原性、不良反应及对转分化过程的抵抗性。Inagawa等[13]也证实了利用逆转录病毒多顺反子GMT载体可以将梗死心肌的成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。

1.3 miRNA参与的直接重编程

Jayawardena等[14]发现 miRNA的特定组合能够在体内外将非心肌细胞直接重新编程成为心肌样细胞。他们证实了单用miR-1就可以诱导成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞，但与miR-133、-208、-499联合作用可使直接重编程的效率显著提高。miR-1、-133、-208、-499不仅可以使心肌样细胞表达心脏标记物，而且还使其具有自发钙瞬变及收缩特性。随后Jayawardena等[15]使用同样的miRNA来评估体内心肌样细胞的形态和生理特性以及对左室收缩功能的影响，结果发现miRNA不仅产生了与成熟心肌细胞相似的肌节结构，而且还可以诱发动作电位及兴奋-收缩耦联反应。经反复超声心动图检查发现，miRNA可在心肌梗死后1个月内减小纤维化面积，并在3个月内逐步改善心室的收缩功能，这提示心功能在逐步改善。该研究认为成纤维细胞的诱导、分化、整合、成熟所需的时间可能是左室收缩功能延迟和逐步改善的原因。

2 非整合型病毒载体直接重编程

2.1 仙台病毒(SeV)载体直接重编程

SeV载体为单负链RNA病毒，具有高效转导、非整合性、低污染等优点，主要用于诱导多能干细胞(iPSC)的研究[16-18]。Miyamoto等[19]证实在体外用SeV-GMT诱导小鼠成纤维细胞1周后就可以出现aMHC-GFP+、α辅肌动蛋白(α-Actinin+)、cTnT+的细胞，这些免疫阳性细胞的数量可持续增长直至第4周，且在第4周心肌样细胞就可以表现出良好的肌节结构。在胚胎成纤维细胞中，用SeV-GMT诱导产生的心肌样细胞比用逆转录病毒GMT诱导产生的多100倍，并且心肌样细胞的跳动时间可以从第25天提前到第10天。与内源性心肌细胞相似，SeV-GMT诱导的心肌样细胞对肾上腺素能和胆碱能刺激均有反应。在体内，SeV-GMT同样可以增加心脏直接重编程的效率，改善心功能，同时减小心肌梗死后的瘢痕面积。SeV-GMT转染后，1.5%的心脏成纤维细胞在1周后被重编程为心肌样细胞，其中约20%具有良好的肌节结构。4周后重编程效率提高至5%，其中约40%的心肌样细胞在形态上趋于成熟。SeV-GMT载体也可以将人成纤维细胞直接重新编程为心肌样细胞，但是该心肌样细胞没有自发性跳动，只有与新生小鼠的心肌细胞共培养1～2周后才可以使心肌样细胞与周围的心肌细胞同步收缩。

2.2 金纳米颗粒(AuNP)/GMT/PEI载体直接重编程

Passaro等[20]提出纳米技术具有独特的靶向定位能力，能维持所负载物质稳定的生物活性，可推广应用于心肌细胞重编程。Chang等[21]证实负载有Gata4、Mef2c和Tbx5的阳离子AuNP确实可用于心肌细胞直接重编程。在体外，与GMT/PEI载体相比，使用AuNP/GMT/PEI载体转染2周后aMHC-GFP+的细胞增加了近3倍，且心肌样细胞产生了具有明显Z线结构的肌节形态。实时荧光定量PCR结果显示，用AuNP/GMT/PEI载体转染后，心肌细胞标记物(Tbx18、Myl2、cTnT和Myh6)显著增加，而成纤维细胞标记物(结蛋白、Fsp1和Col1a1)被显著抑制。在转染5周后，AuNP/GMT/PEI载体诱导产生的能自发跳动的心肌样细胞是GMT/PEI载体的5倍多。在体内，AuNP/GMT/PEI纳米载体转染使小鼠的心肌梗死面积明显减小。AuNP/GMT/PEI纳米载体也可以将人皮肤成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。在用AuNP/GMT/PEI纳米载体转染2周后可以观察到与内源性心肌细胞形态相似的心肌样细胞。

3 直接重编程的可能机制

3.1 抑制成纤维细胞信号增强心肌细胞直接重编程

Zhao等[22]证实了抑制转化生长因子-β或Rho相关激酶(ROCK)参与的促纤维化信号转导途径可以将小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞，且效率高达60%，在抑制促纤维信号后不到2周的时间内即可出现自发跳动的心肌样细胞，而单用GHMT则需要4周。Mohamed等[23]进一步证实了体外联合使用转化生长因子-β抑制剂(SB431542)和WNT抑制剂(XAV939)可使GMT的直接重编程效率提高8倍。在体内，与GMT相比， GMT联合SB431542和XAV939转染可显著提高心肌梗死后小鼠心肌细胞直接重编程的效率，改善其心功能。超声心动图检查发现心脏的每搏输出量、射血分数、心输出量明显改善，瘢痕面积明显减小。进一步分析发现，SB431542可下调纤维化信号，减少细胞外基质的形成[24]，而XAV939下调了与染色质调控、DNA包装和核小体结构相关基因的表达[25]。

3.2 抑制炎性反应增强心肌细胞直接重编程

Muraoka等[26]发现将双氯芬酸钠加入GMT或者GHMT，可显著提高出生后小鼠心脏成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞的效率,但是并不能提高小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞的效率。该研究证实双氯芬酸通过抑制环氧合酶-2、前列腺素E2/前列腺素E受体4、环磷酸腺苷/蛋白激酶a和白细胞介素-1β信号，阻止炎性反应和心肌纤维化的进一步发展，从而提高心肌细胞直接重编程效率。Zhou等[27]也证实了锌指转录因子281(ZNF281)可通过调节心脏和炎性基因的表达，促进心肌细胞直接重编程效率。这提示抑制成纤维细胞信号是心肌细胞直接重编程的先决条件，抗炎可能是促进心肌细胞直接重编程的途径，二者协同作用可能会大大提高心肌细胞直接重编程的效率。

4 展望

心肌细胞再生是富有挑战性的新研究领域。细胞直接重编程技术是指将一种终末分化的细胞直接转变为另一种终末分化的细胞，而不经过iPSC阶段和去分化、再分化等过程。使用整合型逆转录病毒或慢病毒转染诱导产生心肌样细胞可能会破坏内源基因的表达，带来插入突变等风险。最重要的是，使用整合型病毒载体直接重编程的过程缓慢且效率低下，这会阻碍心肌细胞直接重编程技术的发展。因此，学者们探索了适用于体内外心肌细胞直接重编程且效率较高的非整合型病毒载体直接重编程的方法。非整合型病毒载体具有细胞毒性小、转导高效、污染率低等优点，在未来的生物医学再生领域将会有着广阔的应用前景。然而，要将这项技术运用到临床还需要对心肌细胞直接重编程的确切分子机制及其适宜的微环境进行深入研究。