循环肿瘤DNA在消化系统肿瘤中的临床应用

张音洁，王晰程

北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所消化肿瘤内科，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京1001420

常见的消化系统肿瘤包括食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌和结直肠癌等，中国发病率前十的恶性肿瘤中，消化系统肿瘤占据一半，且部分肿瘤的发病率呈上升趋势[1]。因此，消化系统肿瘤的早期诊断、疗效预测及预后改善是临床科研工作者的研究重点。随着“精准医疗”时代的到来，人们对肿瘤的治疗更加细化，需要精准监测肿瘤进展，但传统活检技术无法在同一患者身上反复多次进行，并且不同肿瘤病灶的基因状态和生物学行为存在明显的异质性。因此，液体活检技术这一新兴的病理检测手段应运而生。液体活检主要包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌体（exosome）、微小RNA（microRNA，miRNA）等的检测，主要检测包含血液、唾液、尿液、腹腔积液、胸腔积液、脑脊液在内的体液[2]。作为一种新型肿瘤标志物，ctDNA因其操作简便、侵害性小、易于动态监测等优势，在消化系统肿瘤领域获得了广泛研究，并可为肿瘤筛查或早期诊断、术后检测残余病灶及预测复发、指导靶向用药、动态监测治疗效果、判断预后等提供有利依据。本文主要对ctDNA在消化系统肿瘤中的临床应用现状和前景进行阐述。

1 ctDNA概述

1948年，Mandel和Metais[3]首先报道血液中存在片段化的DNA，即血浆游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）。1977年，Leon等[4]观察到肿瘤患者的血浆cfDNA水平明显高于健康人群，而化疗后cfDNA水平会降低。1994年，科学家第1次在cfDNA中检测到KRAS基因突变，从而证实这种携带了突变信息的循环DNA来源于肿瘤细胞[5]。ctDNA是原发肿瘤组织、CTC和其他器官组织中转移灶通过坏死、凋亡或直接分泌的方式释放到外周血的cfDNA[6-7]。ctDNA携带了肿瘤的基因变异特征，如突变、插入、缺失、重排、拷贝数异常和甲基化等，这一特点使其成为重要的生物标志物[8]。ctDNA片段大小不等，在70～200 bp的小片段至21 000 bp的大分子内波动，并且较非肿瘤性cfDNA大[7]；其数量和性质受到多种因素影响，例如肿瘤负荷大小、肿瘤状态、DNA的清除及降解机制等[9]。此外，ctDNA水平也受非肿瘤特异性的生理或病理机制影响，如炎性反应或组织损伤[10]。ctDNA的半衰期大约为2 h[2]。其检测技术类型繁多，每种分析方法均具有其各自的适用范围，各有利弊，主要的检测技术是以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）或二代测序（next generation sequencing，NGS）为基础的高灵敏度、高通量检测技术，它们可以在血液中大量正常的cfDNA中辨别出少量的肿瘤DNA。以PCR为基础的常用检测方法的灵敏度较高，可达0.001%～0.1%，包括数字PCR（digital PCR，dPCR）、微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、BEAMing技术（beads，emulsion，amplification，magnetics），而 以NGS为基础的高通量检测方法可以提供更多的基因组学信息，常用的检测方法包括全基因组测序、全外显子测序、标记扩增深度测序（tagged-amplicon deep sequencing，TAm-Seq）、安全测序系统（safe-sequencing system，Safe-SeqS）等[2]。

2 ctDNA在消化系统肿瘤中的应用

ctDNA在临床实践中具有较高的应用价值，其通过无创、便捷的检测手段，实时监测疾病的发展，指导临床选择治疗策略，弥补了传统病理检测有创、活检组织量小等不足。目前，ctDNA检测已在消化系统肿瘤的全程管理中崭露头角，在疾病的不同分期中均可发挥作用，具体可归纳为以下3个方面。

2.1 肿瘤筛查或早期诊断

针对合并早期危险因素的肿瘤患者采用有效的技术实现早诊早治，可有助于改善患者预后。目前，ctDNA检测为食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌的早期诊断开拓了视野。

多项研究发现肿瘤患者和健康者的血浆ctDNA水平具有差异。Kim等[11]研究发现，胃癌患者的血浆cfDNA水平明显高于健康者，且进展期胃癌患者的血浆cfDNA水平高于早期胃癌患者。Park等[12]研究发现，胃癌患者的血浆cfDNA水平为健康者的2.4倍。Sikora等[13]研究发现，胰腺导管腺癌患者的cfDNA水平明显高于慢性胰腺炎患者及健康者。Chen等[14]研究发现，39例原发性肝细胞癌患者中，22例患者的cfDNA水平升高；45例健康者中，2例cfDNA水平升高。研究表明，ctDNA在多种晚期肿瘤患者中的检出率高于85%，但在早期肿瘤患者中其检出率偏低[15]。因此，仅通过检测ctDNA水平实现肿瘤的早期筛查，效果差强人意。一项来自霍普金斯医学院的研究结合ctDNA检测和生物标志物[糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）]检测早期胰腺癌，其灵敏度提高到64.0%，并且显示出极高的特异度（99.5%）[16]。

表观遗传改变是肿瘤发生过程中的早期事件之一，包括DNA甲基化、组蛋白修饰等。ctDNA可反映肿瘤患者的表观遗传学特征，通过检测表观遗传改变可以对肿瘤进行早期诊断。Lofton-Day等[17]研究发现，SEPT9基因甲基化与结直肠癌的发生有关，其在结直肠癌的早期诊断中具有潜力。此后多项国内外临床研究均证实血浆SEPT9基因甲基化适用于结直肠癌的早期诊断，其灵敏度为79.3%～95.6%，特异度为84.8%～99.0%[18-21]。ctDNA甲基化分析同样可能适用于肝癌的早期诊断。Iyer等[22]比较了28例肝细胞癌患者血浆DNA和配对肿瘤组织中某些抑癌基因（APC、FHIT、p15、p16、E-cadherin）的表达情况，结果发现这两种标本之间的上述抑癌基因具有显著的一致性，说明ctDNA可用于检测甲基化。Wong等[23]对25位原发性肝细胞癌患者进行研究，结果发现，92%的原发性肝细胞癌患者中检测到p15和p16基因甲基化，但在慢性肝炎、肝硬化及健康对照组中并未检测到p15和p16基因甲基化，并且具有肿瘤组织和血浆ctDNA一致性甲基化变异的患者更易发生肿瘤转移。研究显示，RASSF1A基因和p16INK4a基因的甲基化在原发性肝细胞癌筛查中具有一定的应用价值[24-25]。5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）是近年来发现的新型表观遗传学标志物。研究表明，基于5hmC的cfDNA检测在结直肠癌和胃癌的诊断中具有较高的应用价值，与组织标本检测5hmC相差无几，且优于常规的生物标志物检测[26]。研究指出，5hmC也可能成为食管癌无创诊断的新型生物标志物[27]。

ctDNA应用于肿瘤早期诊断的另一个难题即发现肿瘤相关的基因突变后，如何确定肿瘤的来源。2017年美国加州大学圣地亚哥研究团队揭示表观遗传学检测可帮助确定肿瘤发生的位置，该团队发现人体中的每个组织都有其独特的甲基化谱，通过筛查血浆中cfDNA的CpG甲基化单倍型标签可以实现对癌变组织的定位，该方法诊断结肠癌的灵敏度和特异度均超过90%[28]。

目前采用ctDNA检测技术对早期肿瘤患者进行诊断依然处于科研探索阶段，更加广泛的临床应用尚需更多循证医学证据的支持。

2.2 术后检测残余病灶及预测复发

ctDNA的半衰期较短，仅允许在几个小时的间隔内动态评估肿瘤状态，这种快速清除使ctDNA检测可以更加精确地监测肿瘤患者治疗过程中的肿瘤动态和负荷变化，有助于检测手术切除患者的残余病灶及预测复发，且往往可提前于传统的影像学检查发现复发。

2002年的一项回顾性研究发现，经过治疗的25例I～Ⅲ期结直肠癌患者中，ctDNA阳性患者的2年无复发生存率（recurrence-free survival，RFS）为66%，而ctDNA阴性患者的2年RFS为100%，进一步分析结果显示，ctDNA可预示结直肠癌患者的复发风险和总生存期[29]。另一项前瞻性研究纳入了230例行根治性切除的Ⅱ期结肠癌患者，其中178例患者未行辅助化疗。14例患者术后检测ctDNA呈阳性，其中11例患者中位随访27个月后出现复发；在164例术后ctDNA阴性患者中，仅16例患者出现复发。在接受辅助化疗的患者中，化疗结束后ctDNA阳性与较低的RFS有关[30]。最新的研究纳入了95例Ⅲ期结肠癌患者，所有患者术后均接受辅助化疗，其中19例患者术后ctDNA呈阳性。该研究发现，术后ctDNA阳性患者的RFS低于术后ctDNA阴性患者，化疗2个月后，59%的患者ctDNA由阳性转为阴性，同时这部分术后ctDNA转阴患者的RFS更高，而术后ctDNA由阴性转为阳性患者的RFS较低[31]。以上结果均提示ctDNA可显示出影像学无法展示的残留肿瘤情况，并可以作为辅助治疗的疗效评估指标。

ctDNA水平与肿瘤负荷及分期有关，结合结直肠癌分子特征，监测ctDNA中特定基因突变位点、异常甲基化和拷贝数变异水平的变化，有利于评价肿瘤治疗效果、微小残留病灶，其作为监测复发和预后评估的指标，较现有临床常用的血浆蛋白标志物可能具有更高的灵敏度和特异度。Diehl等[32]研究发现，结直肠癌患者在接受根治性切除术后的2～10天内ctDNA突变基因数目明显减少，而接受非根治性手术的患者ctDNA的突变基因数目略减少或有所增加。Reinert等[33]利用ctDNA高通量测序技术对11例结直肠癌患者进行术后长达3年的复发监测，采用了体细胞结构变异（somatic structure variation，SSV）作为监测指标，其中6例复发，5例未复发。结果发现，复发患者的ctDNA中SSV频率升高，而未复发患者的SSV频率一直处于较低水平，SSV在检测术后复发方面的灵敏度和特异度均为100%。该研究还显示，利用ctDNA监测复发较影像学检查平均提前10个月发现复发征兆。

2.3 指导靶向用药、动态监测治疗效果和判断预后

对于失去手术时机的晚期肿瘤患者，主要的治疗策略是以全身系统治疗为主的综合治疗。在过去的20年内，靶向治疗蓬勃发展，已在多种肿瘤中广泛应用，制定个体化治疗策略是目前精准医疗发展的核心。目前，以ctDNA中基因突变信息为基础的肿瘤分子分型能够极大地方便肿瘤个体化治疗的靶点选择。

人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是目前胃癌靶向治疗研究中最主要的靶点之一。来自北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科的研究对晚期胃癌患者的ctDNA和配对肿瘤组织中HER2扩增的一致性进行分析，结果显示，ctDNA的HER2扩增与肿瘤组织的HER2扩增具有高度一致性（91.4%），表明基于ctDNA的评估可以部分克服肿瘤异质性，并可成为胃癌患者HER2分析的潜在替代指标[34]。研究报道，结直肠癌组织中的KRAS突变状态与ctDNA中的KRAS突变状态高度一致（78.3%～97.0%），NRAS和BRAF突变也是如此[15,35-37]。值得注意的是，在一些情况下，基于血液分析可检测到手术标本中未检测到的KRAS突变[35]。这可能反映了组织活检中遗漏的但被ctDNA捕获的肿瘤异质性，并说明了使用肿瘤组织作为金标准的不足。另一项研究通过ctDNA分析发现，结直肠癌患者KRAS、NRAS和BRAF突变的比例分别为59.0%、11.8%和14.4%，而通过肿瘤组织分析发现，其突变比例分别为44.0%、8.8%和7.2%，并且ctDNA分析可快速得到结果，通过肿瘤组织分析的中位结果回报时间为16天，而ctDNA分析则为2天[38]。美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）的一项研究为转移性结直肠癌患者靶向治疗前使用ctDNA检测功能性基因融合提供了依据[39]。该研究选取了未接受抗肿瘤治疗的结直肠癌患者的外周血进行ctDNA测序，4290例患者中，41例（0.96%）患者检测出45种独特的基因融合，其中，RET基因融合16例（0.37%）、FGFR3基因融合13例（0.30%）、ALK基因融合10例（0.23%）、NTRK1基因融合3例（0.07%）、ROS1基因融合2例（0.05%）、FGFR2基因融合1例（0.02%），4例患者发生多个基因融合现象，FGFR基因融合与RAS基因突变相关（OR=3.5，P=0.03），全部NTRK1基因融合均为KRAS/NRAS/BRAF野生型，基因组改变在出现基因融合的患者中更为常见。这是针对结直肠癌患者的首个大型系列研究，结果证明，基于血浆检测融合基因是可行的，这些少见特殊基因突变的检出为患者提供了新的治疗可能。

靶向药物的使用往往会面临耐药现象，通过外周血ctDNA的多时间点动态监测可以得出循环肿瘤分子的变化谱。循环基因组的每个时间点的状态能够代表肿瘤不同区域的异质性，有助于更早地确认和发现治疗耐药性[40]。Misale等[41]利用ctDNA对西妥昔单抗或帕尼单抗耐药的结直肠癌患者进行分析，结果显示，60%的患者获得了继发性KRAS突变，并且这种改变较影像学检查发现的疾病进展提前了10个月。另一项研究选取了28例予以帕尼单抗治疗的转移性结直肠癌患者，其中24例为KRAS野生型，通过ctDNA检测发现，9例KRAS野生型患者治疗过程中可检测出KRAS突变，其中3例患者可检测出多种不同形式的KRAS突变。这种突变在治疗前就以低频亚克隆的形式存在，在治疗5～6个月时突变频率明显升高。该研究提示ctDNA检测可突破组织检测的局限性，更好地反映肿瘤基因突变全貌[42]。克唑替尼是一种有效的间质表皮转化因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）抑制剂，已被证实对MET扩增的食管癌和胃癌有效，约5%的胃癌患者发生MET扩增，克唑替尼治疗不久即发生耐药[43]。有研究通过ctDNA分析Ⅳ期胃癌患者接受克唑替尼治疗2个月发生耐药的分子机制，结果发现，多重继发MET突变、FGFR2基因相对拷贝数显著增加及其他相关下游信号的突变是导致MET抑制剂无效的原因[44]。

除此以外，ctDNA检测可动态监测晚期肿瘤患者的治疗效果，可较影像学疗效评价提前，从而更好地判断预后。目前有许多利用ctDNA检测基因突变频率并证实与肿瘤预后相关的研究，鉴于目前ctDNA对预后分析的价值得到了越来越多的关注，有研究者提议将外周血ctDNA检测的结果纳入更新的TNM肿瘤分期系统，即“TNMB”分期系统，可能有更好的诊断、治疗及预后评估价值。“B”的定义为未检测到（“B0”）或检测到（“B1”）ctDNA。该文提出，未来可对此TNMB系统进行修订，以纳入不同瘤种具有临床意义的ctDNA量化界值[45]。Tjensvoll[46]等分别收集了胰腺癌患者化疗前和化疗后每个月的血浆样本，连续监测了14例晚期胰腺癌患者血液ctDNA的KRAS基因变化情况（存在KRAS突变即ctDNA阳性），在化疗前ctDNA阳性的10例患者中，其ctDNA水平的改变与影像学评估具有一致性，其中3例患者的ctDNA变化较依据实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）的疗效评价提前1～2个月。Lecomte等[29]研究发现，KRAS突变及CDKN2A启动子超甲基化的结直肠癌患者的2年整体生存率仅为48%，而无上述基因突变患者的2年整体生存率可达100%。该研究发现，ctDNA中KRAS突变或CDKN2A启动子超甲基化可能是结直肠癌的独立预后因素。Fang等[47]对277例进展期胃癌患者的8个基因（共68个突变）进行ctDNA的突变研究，最后证实高ctDNA水平与晚期胃癌患者腹膜复发及预后不良有关，并且存在ctDNA突变的晚期胃癌患者预后不良。Ling等[48]通过ctDNA检测食管鳞癌患者的MSH2基因甲基化程度，发现MSH2高甲基化患者的术后无病生存率（disease-free survival，DFS）明显低于MSH2未甲基化患者。胃肠道肿瘤方面，HERACLES试验（NCT02476045）证实血浆HER2（ERBB2）拷贝数可预测HER2靶向治疗效果。该研究发现，ctDNA可检测出96%ERBB2基因扩增的样本，并能准确预测HER2靶向治疗的缓解率，基于HERACLES试验和大型临床队列研究，将血浆中ERBB2的拷贝数阈值设定为3，可用来预测从HER2靶向治疗中受益的患者[49]。

如何更好地预测免疫治疗的疗效，尤其是如何区分免疫治疗的真性进展和假性进展一直是研究者关注的重点。Lee等[50]对使用免疫治疗的黑色素瘤患者连续进行ctDNA检测，并区分出了免疫治疗的真性进展和假性进展，该研究纳入125例接受派姆单抗（pembrolizumab）或纳武单抗（nivolumab）联合或不联合伊匹单抗（ipilimumab）治疗的Ⅳ期黑色素瘤患者，应用RECIST1.1及免疫相关反应标准（immune-related response criteria，irRC）进行疗效评价，假性进展定义为第1次影像学评估（开始进行免疫治疗后第12周）时肿瘤负荷增加25%，但在第2次影像学评估中疾病进展没有得到确认。其中29例患者在第1次疗效评价时，疾病出现进展，其中真性进展患者20例，假性进展患者9例。9例假性进展的患者中，2例（22%）患者基线时和治疗后均无法检测到ctDNA；4例（44%）患者基线时可以检测到ctDNA，但治疗后无法检测到ctDNA；3例（33%）患者12周后ctDNA浓度下降至基线的1/10以下。20例真性进展的患者中，18例（90%）患者的ctDNA水平升高。结果表明，采用ctDNA变化谱识别假性进展的灵敏度为90%，特异度为100%。尽管这一研究结果是在黑色素瘤患者中进行探索的，但对于消化系统肿瘤也有借鉴意义。

因此，对于不可切除的晚期肿瘤患者，ctDNA可动态监测化疗及靶向治疗的效果及耐药性，从而帮助医师了解治疗疗效、判断预后及选择更合适的治疗策略。

3 ctDNA检测的局限性和面临的挑战

ctDNA作为液体活检的重要组成部分，在消化系统肿瘤个体化诊疗的不同阶段和方面发挥着越来越重要的作用，应用前景广阔，但发展过程中面临很多质疑和挑战，还有很多问题需要解决。第一，液体活检技术种类众多，但是缺乏行业标准，而临床中对于任何一项面向患者的检测技术，对特异度、灵敏度和检测稳定性都有较高的要求。尽管最近开发了非常敏感的技术，但将液体活检技术应用于肿瘤早期筛查尚需时间，特别是在广泛的人群中筛查需要精确的特异性。肿瘤相关的基因突变随着年龄的增长而发生，即使是在一生中从未发生过肿瘤的个体也有可能会携带某些特定的突变基因[51]，这可能导致假阳性结果。第二，现有的ctDNA检测收费较为昂贵，如何改进技术并降低成本，减轻肿瘤患者的经济负担仍需努力。第三，尽管液体活检全面应用于临床实践是必然趋势，但仍需更多大型临床研究验证，尤其是前瞻性研究。

ASCO和美国病理医师学会组织了专家委员会，对已发表的1338篇临床ctDNA检测的论文进行综述，从分析效度、临床有效性及临床效用对ctDNA的临床应用进行剖析，文中特别指出，在比较肿瘤组织和血浆中致病突变基因的一致性时，很多生物学因素可能影响这种一致性，例如肿瘤类型、肿瘤异质性、组织和血液取样时间、突变为克隆或亚克隆。文中还指出，当前尚未有可靠的证据证明ctDNA对肿瘤动态检测的临床有效性。对于临床期待的ctDNA对早期肿瘤的筛查，专家委员会认为其临床有效性证据相当有限，也没有足够的证据支持ctDNA检测对患者预后和治疗费用有所改善，这篇文章并不是否定ctDNA未来应用的价值，而更多的是给ctDNA液体活检带来更为理性的分析和思考[52]。

4 小结与展望

在精准医疗的背景下，以ctDNA为代表的液体活检技术以其独有的优势迅速渗透到肿瘤学基础和临床研究的方方面面。ctDNA在临床中能够对不同时期的肿瘤发挥作用：可实现早期筛查、诊断；肿瘤切除后检测残余病灶、监测复发；帮助晚期患者更好地选择靶向药物，动态监测治疗疗效，进行有效的预后评估以达到治疗效果最大化。液体活检推动了个体化治疗及精准医疗的步伐，但目前还需要大规模的队列研究来确定其对不同疾病的有效性和敏感性。