FGF7亚家族在胚胎期小鼠毛囊形成过程中的差异表达

吴晋强 ，曹 靖 ，程笳琪 ，闫瑞琴 ，陆 娜 ，张娇娇 ，吴佳豪 ，张鹏翔 ，赫晓燕

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.北京农业职业学院，北京102442）

毛囊是动物最复杂的微型器官之一，具有重建自身的能力[1-4]。毛胚细胞（Hair germs cell）被确认是早期的毛囊前体细胞。当表皮基底层细胞下陷进入被聚集的间充质细胞包围的真皮中时，形成毛胚细胞；毛胚细胞继续伸长之后被称为毛脚或毛钉。被相关间充质细胞包围的毛钉变平的末端，形成一个球根状凹面的结构[5]，形成凹状面的上皮细胞变成基体，并产生内根鞘和纤维。毛囊两侧的剩余间充质细胞变成外根鞘，在毛囊的中部区域细胞组织形成皮脂腺的原基和隆起部分[6]。有研究表明，小鼠胚胎第13天是毛囊形成前期，毛胚细胞没有明显向下凹陷；胚胎第14天毛囊形成开始，毛胚细胞向下凹陷；胚胎第15天毛胚细胞继续向下凹陷形成毛钉；胚胎第16天时向下凹陷形成球根状毛钉；胚胎第17天时毛囊初步形成[1-2]。

成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factors，FGF）家族可分为7个亚家族，其中，FGF7亚家族成员包括 FGF7，FGF10，FGF22[7-8]。FGF7 又称为角质形成细胞生长因子（Keratinocyte growth factor1 KGF1）[9]，其是上皮细胞的特异性促分裂原，对上皮细胞旁分泌介质起到增殖的作用[10]；FGF10是一个典型的旁分泌型FGF[11]，其以旁分泌的方式介导间充质与上皮信号传导，在腺体、被毛、牙齿等器官中发挥重要的作用[12]；FGF22与FGF7和FGF10不同，FGF22蛋白质缺乏大多数分泌型FGF应有的特征，即N-糖基化的共有序列，因此，FGF22的表达相对受限[13-14]。

FGF7亚家族在毛囊发育领域的作用受到越来越多的关注。然而，有关FGF7亚家族对小鼠胚胎毛囊形成作用的研究未见报道。

本试验将选取 13～17 d（E13d～E17d）的胚胎期小鼠作为试验材料，利用免疫组织化学和Western blot方法研究FGF7亚家族成员在胚胎期小鼠毛囊形成过程中的表达，旨在了解FGF7亚家族在小鼠胚胎毛囊形成过程中的作用，为进一步揭示胚胎期小鼠毛囊的形成及调控机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

兔Streptavidin-HRP试剂盒（康为）；兔抗FGF7多克隆抗体（美国Thermo）；兔抗FGF10多克隆抗体（美国 Santa Cruz Biotechnology）；兔抗 FGF22多克隆抗体（美国Novus Biologicals）。

1.2 试验动物及取材

50只ICR小鼠购自山西医科大学（40只小鼠为雌性小鼠，10只小鼠为雄性小鼠）。晚上将雄鼠和雌鼠按1∶4的比例合笼，第2天早查看母鼠阴道栓进行分笼，并标记为怀孕第1天。13～17 d每天取1只孕鼠，处死后取3个完整的胚胎放入Bouin氏固定液中固定24 h后，常规制片，片厚6 μm，用于免疫组织化学分析[15]。另外3只胚胎取其背部皮肤快速放入液氮中，用于提取总蛋白。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学 根据兔Streptavidin-HRP试剂盒说明书，在组织切片上滴加试剂盒中的试剂。将组织切片的一侧与以下抗体一起孵育：1∶60稀释的兔抗FGF7多克隆抗体；1∶45稀释的兔抗FGF10多克隆抗体；1∶50稀释的兔抗FGF22多克隆抗体。将组织切片的另一侧在PBS中于4℃温育14 h，在室温下储存30 min后，将组织切片在振荡器上洗涤3次，每次3 min。将组织切片用山羊抗兔二抗溶液在室温下孵育10 min。洗涤后，将组织切片孵育DAB色溶液，随时观察显色状况，直至获得最佳结果。用LEICA DMLB2的Leica光学显微镜采集图像。

1.3.2 Western blot检测 取液氮罐中保存的小鼠皮肤组织，按总蛋白提取试剂盒（碧云天）提供的操作步骤提取小鼠皮肤的总蛋白，使用ND-1000微量核酸蛋白测定仪测定其浓度。每个样品的总蛋白量为400 μg，在15%的SDS-PAGE进行电泳分离，电泳完毕后转移至NC膜；将NC膜放入5%的脱脂蛋白干粉对其进行封闭1 h，4℃孵育一抗过夜（FGF7兔抗多克隆抗体1∶800；FGF10兔抗多克隆抗体1∶500；FGF22兔抗多克隆抗体1∶700）。次日复温30 min后，用TBST洗膜，共洗3次，每次10 min。加入经TBST溶液稀释的二抗（1∶12 000，HRP-山羊抗兔IgG，康为世纪公司），37℃孵育90 min。用TBST洗膜，共洗4次，每次5 min。运用ECL试剂盒在暗室中进行曝光之后，对其信号条带进行扫描。利用 Image J分析 FGF7，FGF10和FGF22蛋白和β-actin蛋白条带灰度值。

1.4 数据分析

免疫组化光密度值用平均值±标准差表示，Western blot统计结果利用SPSS17.0统计分析软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 免疫组织化学试验结果

2.1.1 FGF7免疫组织化学试验结果 试验结果显示，在E13d，FGF7蛋白表达相对较弱；在E14d～E16d，FGF7主要在毛胚细胞、毛钉、球根状毛钉、表皮和真皮细胞中观察到；在E17d，FGF7主要在表皮细胞中表达，并且在球根状毛钉中几乎没有观察到阳性FGF7信号（图1）。光密度数据分析结果显示（表 1），FGF7 蛋白在 E14d，E15d，E16d 和 E17d的表达量分别是E13d的1.712倍（P＜0.001），1.670 倍（P＜0.001），1.376 倍（P＜0.001），1.280 倍（P＜0.001，图 2-A）。

2.1.2 FGF10免疫组织化学试验结果 试验结果显示，FGF10蛋白主要在毛胚细胞、毛钉、球根状毛钉、表皮和真皮细胞中观察到。FGF10蛋白在E15d阳性反应最强；在E14d和E16d，主要在表皮细胞中观察到FGF10。随着时间的推移，FGF10阳性信号逐渐减弱（图3）。光密度数据分析结果显示（表1），FGF10 蛋白在 E14d，E15d，E16d 和 E17d 的表达量分别是E13d的1.461倍（P＜0.001），1.917倍（P＜0.001），1.545 倍 （P＜0.001），1.129 倍 （P＜0.001，图 2-B）。

表1 FGF7/10/22蛋白在小鼠皮肤中阳性反应物的平均光密度

2.1.3 FGF22免疫组织化学试验结果 试验结果显示，FGF22蛋白在毛胚细胞、毛钉、球根状毛钉、表皮和真皮细胞中均有广泛表达（图4）。光密度数据分析结果显示（表1），FGF22蛋白在E13d，E15d，E16d和E17d的表达量分别是E14d的1.031倍（P＜0.05），1.136 倍 （P＜0.001），2.086 倍 （P＜0.001），2.324 倍（P＜0.001，图 2-C）。

2.2 Western blot试验结果

Western blot试验结果显示，FGF7，FGF10 和FGF22在不同日龄小鼠的背部皮肤中均有表达，相对分子量大小分别为28，23，21 ku。Image J软件的分析结果表明，FGF7在E14d表达量最高，在E17d表达量最低（图5-A）；FGF7蛋白在E13d，E14d，E15d和E16d的表达量分别是E17d的1.14倍（P＜0.001），1.20 倍（P＜0.001），1.17 倍（P＜0.001），1.06倍（P＜0.01，图 5-B）。FGF10在 E15d表达量最高，在E13d表达量最低（图5-A）；FGF10蛋白在E14d，E15d，E16d和 E17d的表达量分别是 E13d 的3.11 倍（P＜0.001），3.57 倍（P＜0.001），3.04 倍（P＜0.001），2.65倍（P＜0.001，图 5-C）。FGF22 在 E17d表达量最高，在E14d表达量最低（图5-A）；FGF22蛋白在E13d，E15d，E16d和E17d的表达量分别是E14d的 1.04倍（P＞0.05），1.55倍（P＜0.001），1.72倍（P＜0.001）和 1.79 倍（P＜0.001，图 5-D）。

3 讨论

毛囊是一种通过组织生长和重塑循环产生毛发的动态结构，由表皮和真皮2个部分组成[16]，最初是由包围真皮下面一小簇细胞的表面外胚层向下生长而形成。毛囊的形成分为感应诱导、器官发生、细胞分化3个过程，可细分为8个阶段。

FGF7由皮肤中的间充质细胞（如成纤维细胞/纤维细胞）合成和分泌，并由163个氨基酸编码的糖蛋白组成。同时，FGF7充当上皮细胞增殖的旁分泌介质，刺激上皮细胞的迁移、扩散和增殖[17-18]。免疫组织化学和Western blot试验结果显示，FGF7在E14d的表达量最高。结果表明，FGF7在小鼠胚胎期第14天起主要作用。在毛胚细胞、毛钉、球根状毛钉、表皮和真皮细胞中检测到FGF7的表达。毛囊在胚胎阶段的第14天开始形成，此时毛胚的表皮增厚由基底层中的栅栏状样的角质形成细胞组成。表皮基底层的角质形成细胞称为毛胚细胞。毛囊形成的特征是真皮成纤维细胞数量的局部增加，临近于毛胚沉积的表皮增厚[1-2]。研究表明，FGF7在毛囊形成中起重要作用。SCHMID等[19]研究表明，FGF7是一种真皮乳头信号，参与指导毛胚细胞增殖。此外，PETIOT等[20]研究也证明，在小鼠模型试验中，敲除FGF7的受体FGFR2 IIIb导致小鼠的毛囊密度降低和毛囊发育迟缓。结合本试验结果可知，FGF7在毛囊形成中有重要作用，在毛囊形成的启动阶段，可能参与指导毛胚细胞的增殖。

FGF10也称为角质形成细胞生长因子2，其以旁分泌形式介导间充质和上皮细胞信号转导，在多个器官中起重要作用[21]。免疫组织化学和Western blot试验结果显示，FGF10在E15d的表达量最高。结果表明，FGF10在毛囊发育的第15天起主要作用，在毛胚细胞、毛钉、球根状毛钉、表皮和真皮细胞中检测到FGF10的表达。毛胚细胞下陷到真皮中，在E15d和E16d形成毛钉和球根状毛钉，毛胚突起增多，表皮角质形成细胞变长变宽。毛胚细胞呈现出前后极向（毛胚近端朝向头部，远端朝向尾部）[1-2]。研究表明，FGF10在毛钉和球根状毛发钉的形成中起重要作用。在已知的FGF家族成员中，FGF10与FGF7具有功能相似性[22]，其中，FGF10在毛囊形成中有重要作用，在毛囊形成的关键阶段，可能参与指导毛钉和球根状毛发钉的形成。

FGF22是FGF7亚家族的另一成员，其与FGF7和FGF10密切相关。免疫组织化学和Western blot试验结果显示，FGF22在E17d的表达量最高。结果表明，FGF22在毛囊发育的第17天起主要作用，在毛胚细胞、毛钉、球根状毛钉、表皮和真皮细胞中检测到FGF22表达；在第17天时毛囊初步形成，毛钉已经变得高度伸长并且显示出早期毛囊的第一特征：在毛钉尾部的细胞呈现灯泡状增厚，形成一个突出的宽的真皮乳头腔；此时，内根鞘的上皮层或Henle层在真皮乳头上方形成锥形结构[1-2]。研究表明，FGF22在毛钉成熟中起重要作用。具有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）结合位点和CCAAT盒的FGF7启动子和具有双bHLH结合位点的FGF10启动子较为保守，而FGF22启动子则不同[14]。结果显示，FGF22在毛囊中的功能不同于FGF7和FGF10。推测FGF22在毛囊形成和成熟中起重要作用，在毛囊基本形成阶段，可能促进毛钉成熟。

4 结论

本研究表明，在胚胎期小鼠皮肤组织中，FGF7（FGF7/FGF10/FGF22）亚家族主要在毛胚细胞、毛钉、球根状毛钉、表皮和真皮细胞中表达。FGF7亚家族3个成员在胚胎小鼠毛囊形成中均可发挥重要作用，其中，FGF7在毛囊形成的启动阶段即胚胎期第14天发挥主要作用，可能参与指导毛胚细胞的增殖；FGF10在毛囊形成的关键阶段即胚胎期第15天发挥主要作用，可能参与指导毛钉和球根状毛发钉的形成；FGF22在毛囊的基本形成阶段即胚胎期第17天发挥主要作用，可能促进毛钉成熟。