重组UK114蛋白编码基因的序列特征及表达分析

张晓红，宋彩丽，殷惠军，尹淑琴，常 泓

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学期刊社，山西太谷030801）

UK114（山羊肝脏肿瘤抗原）蛋白是钙激活蛋白酶激活蛋白，是μ-calpain的激活蛋白，UK114蛋白是一种低分子量的保守蛋白质，该蛋白质广泛存在于真核和原核类生物中[1]。在UK114蛋白质家族中大约有200多个同源物，表明此类蛋白质在生物体内起着重要的作用[2]。

UK114是UK101蛋白组成之一。分子量约为14 ku。UK101是BARTORELLI等[3]在 1994年从山羊肝脏中发现的一种高氯酸可溶性蛋白，这种蛋白是抗原性的，研究发现，该蛋白质具有抗肿瘤活性。UK101主要由3种不同大小分子量的蛋白质构成：UK110，分子量大小为10 ku；UK114，分子量大小约为14 ku；UK150，分子量大小为50 ku，是富含甘露糖的蛋白质[4-5]。MELLONI等[6-7]研究发现，UK114 蛋白是calpain-1的激活蛋白；PONTREMOLI等[8]对该蛋白的氨基酸顺序进行了测定。朱宏等[9-10]在山羊肝脏中克隆了UK114蛋白基因，研究了它在肉嫩化机理中的作用。在UK114蛋白家族中，尤其是DUK114（果蝇体内UK114的同源物）蛋白，它的结构是保守的，且其功能是由其结构特点决定的[11-12]。FARKAS等[11]研究表明，DUK114是一种分子伴侣，它与Hsp90有相似的功能。CSERMELY等[12]研究推测，DUK114蛋白的调控是发生在蛋白质水平，而不是细胞水平。

蛋白质是生命活动中功能的主要承担者，为此，本研究对该类蛋白质进行了生物信息学分析，主要是对其蛋白质的理化性质、亚细胞定位、蛋白质互作关系以及蛋白质高级结构的预测[13]。由于蛋白质的种类繁多，一些技术不能普遍使用，生物信息学的出现，为蛋白质二、三级结构的获得提供了捷径[14-15]。之前大多都是研究这些基因的结构和功能，对蛋白质的研究相对较少。

本研究通过从山羊肝脏中提取总RNA，经RT-PCR获得目的基因，利用生物信息学分析技术，对其编码的蛋白序列进行结构分析，从而更加清楚地了解其产生功能的机制，为其奠定理论基础，也为后期深入研究UK114蛋白结构功能等研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 将新鲜的山羊肝脏组织（取自山西省太谷县范村），用剪刀剪成数块，用锡箔纸包好，置于液氮罐中带回，放到-80℃冰箱保存。

1.1.2 试剂 总RNA抽提试剂盒，RT-PCR试剂盒，DNA Marker 2 000，Taq DNA 聚合酶，dNTP，琼脂糖，均购自索莱宝公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 参考GenBank提供的山羊UK114核酸序列，使用Primer 5.0在线软件设计引物，由北京擎科新业生物技术有限公司合成，序列如下。

正向：5′-AAGGATCCATGTCGTCTTTGG-3′；反向：5′-GAACTCGAGTTAGAGTGATGCTGTC-3′。

1.2.2 总RNA抽提与RT-PCR 使用总RNA提取试剂盒提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度，使用RT-PCR试剂盒对RNA进行反转录和PCR 扩增，反应体系为 50 μL：ddH2O 为 36.5 μL，10×PCR Buffer为 5 μL，dNTPS 为 1 μL，引物 1 为1 μL，引物 2 为 1μL，Taq酶为 0.5 μL，反转录 cDNA为5μL。

PCR反应程序：94℃预变性2 min；94℃高温变性30 s，55℃低温退火30 s，72℃延伸 1 min，30个循环；然后72℃延伸5 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用胶回收试剂盒进行胶回收纯化，送去生工公司测序。

1.2.3 生物信息学分析 本次试验中生物信息学分析均采用网上在线软件，即运用ExPasy-Prot-Param在线软件分析蛋白质的基本理化性质；运用SignalP 4.1 Server，ExPASY-ProtScale分别进行蛋白质信号肽预测和疏水性分析；运用NetPhos 3.1 server，Prosite在线软件分析其磷酸化位点，运用NetNGlyc 1.0 Server，NetNGlyc 4.0 Server在线软件分析N-糖基化位点和O-糖基化位点；运用SOMPA，SWISS-MODEL分别对蛋白质的二级结构和三级结构进行预测分析[16]。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR结果分析

使用总RNA提取试剂盒提取总RNA后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度，使用RT-PCR试剂盒对RNA进行反转录和PCR扩增，再用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。由图1可知，该克隆目的基因约为414 bp，与预期结果一致。其中泳道1，2，3号条带颜色较浅，说明DNA浓度较低，4，5号泳道条带较亮，符合进行后续试验要求。

2.2 UK114基因测序及编码蛋白质的理化性质分析

测序结果如图2所示，该基因序列的长度为414 bp，编码137个氨基酸。

使用ExPasy-ProtParam软件分析该基因编码的蛋白质理化性质，结果表明，该蛋白由137个氨基酸残基组成，分子量约14.3 ku；理论等电点为6.19。由表1可知，UK114蛋白质氨基酸序列中丙氨酸（Ala）含量最高，占到15.3%；其次是缬氨酸（Val），占到10.2%；组成蛋白质的20种氨基酸中不含组氨酸（His）和色氨酸（Trp）。

表1 UK114蛋白质氨基酸含量

2.3 蛋白质疏水性、磷酸化位点和模体分析

氨基酸标度是给每种氨基酸指定的数值，如分子质量、密码子数等，Hphob./Kyte&Doolittle代表氨基酸指定的数值，可测定蛋白质的亲疏水性。如图3所示，该蛋白亲水性最强区域在90～100，疏水性最强区域在80左右。

蛋白质的磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上。经NetPhos 3.1-磷酸化位点分析，如图4所示，有7个潜在的磷酸化位点，其中包括4个丝氨酸位点和2个苏氨酸位点。蛋白质模体也成为保守结构域，蛋白质的保守结构域决定了蛋白质在进化上的稳定性，与蛋白质功能密切相关，对了解一个蛋白质很重要。从图5可以看出，该蛋白质的保守结构域位于C端，第105～123个氨基酸之间。

2.4 蛋白质信号肽及糖基化预测

信号肽作为重要的细胞因子起作用，如图6所示，Signal-IP信号肽预测，最大c值（cleavage site score，剪切位置分值）为0.169，最大s值（signal peptide score，信号肽分值）为0.183，最大y值（combined cleavage sitescore）为 0.155；从图 6 还可以看出，UK114蛋白没有信号肽。如图7所示，经过NetNGlyc1.0 Sever-N-糖基化位点分析表明，重组UK114蛋白没有糖基化位点。

2.5 蛋白质二级结构预测

使用SOPMA软件对UK114蛋白二级结构进行分析，结果如图8所示，该蛋白质由35.04%的α螺旋（Hh）、37.23%的无规则卷曲（Cc）、21.17%的 β折叠（Ee）和6.57%的β转角（Tt）组成。其中，α螺旋和无规则卷曲为主要结构，β转角含量相对较少。

2.6 蛋白质三级结构预测

蛋白质三级结构的预测，对其功能研究、细胞组织中定位、药物设计等方面有着重要的作用。由图9可知，α螺旋主要位于N端，β折叠主要位于C端，上边已知保守区域在氨基酸的C端。因此，推测该蛋白的功能区域主要位于N端的α螺旋区域。

3 结论与讨论

蛋白质中氨基酸的排列顺序决定了蛋白质的一级结构，一级结构决定了高级结构，高级结构决定了蛋白质的具体功能，所以蛋白质的功能与氨基酸的排列顺序密不可分。蛋白质中氨基酸不同种类的含量决定了氨基酸的亲疏水性，也决定了蛋白质的等电点，所以是否含有特征性的氨基酸对了解蛋白质的功能起决定性的作用。本研究获得一段完整的开放阅读框基因序列，由414个核苷酸组成，可以编码137个氨基酸，分子量为14 ku，等电点为6.19，整体偏弱酸性；氨基酸序列中丙氨酸含量最高。

蛋白质的疏水性对蛋白质的稳定性、构象和蛋白质功能具有重要意义[17]。信号肽的作用是为了保证其在内质网中完成初步的N－连接糖基化修饰以及折叠[18]，糖基化对蛋白质有重要的修饰作用，可以影响蛋白质的结构，也可以增强蛋白质的稳定性[19]，蛋白质糖基化修饰中N－连接糖基化修饰是最常见的蛋白糖基化修饰[20]，该蛋白中没有信号肽，可能因此导致也没有糖基化位点，所以该蛋白稳定性不高，这可能会给后续试验带来一定的难度。蛋白质的磷酸化和去磷酸化在生物体蛋白质翻译后修饰体系中起着非常重要的作用[21]，本蛋白有23个磷酸化位点，其中，丝氨酸和苏氨酸位点较多，因此，它可能参与细胞的信号转导、分裂等生理生化过程。

认识蛋白质的二级结构是了解蛋白质的折叠模式和三级结构的基础，并为研究蛋白质的功能以及它们之间的相互作用模式提供结构基础[22]，预测蛋白质二级结构结果显示，α螺旋占到了35.04%，不规则卷曲占到37.23%，β折叠占13.14%。蛋白质三级结构的预测可以指导药物设计、组织定位及功能研究等各个方面的工作[23]。本研究用SWISSMODEL在线软件对UK114的氨基酸进行三级结构预测，结果表明，N端主要是α螺旋，C端主要是β折叠，保守区域也在氨基酸的C端。因此推测该蛋白的功能区域主要位于N端的α螺旋区域，在之后的研究中可将研究重点放到对α螺旋的研究上。