大麦单粒种子起源的小孢子培养再生频率研究

郭桂梅,何 婷,刘成洪,高润红,徐红卫,李颖波,黄剑华,王亦菲,陆瑞菊

(上海市农业科学院生物技术研究所/上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106)

远缘杂交是向栽培品种导入优异基因的有效方法，但杂交成功率、结实率均较低。遗传背景相同的纯合群体可以大幅度减少来自供试材料引起的试验误差，但是，其构建费时、费力。源于单粒种子的小孢子培养高频再生技术可以有效克服上述难题。

大麦小孢子培养技术已日趋成熟[1-2]，大量再生绿苗的获得为加快大麦育种进程和相关的机理分析提供了有利条件。陆瑞菊等[3-4]建立了大麦大田取材高效的小孢子培养体系；郭桂梅等[5]建立了温室单粒种子分蘖穗高效形成技术。影响游离小孢子培养效率的因素复杂、繁多，对小孢子培养的供体植株、取材时期、前期预处理、诱导培养基、分化、植株再生等诸多方面均有研究报道[2]。有关单株培养的效率研究还未见报道。

本研究以大麦花30经小孢子培养获得的加倍单倍体株系为供试材料，在已有研究基础上[3-9]，于可控的人工气候室中，研究离体穗预处理时间、离体小花预处理时间和诱导培养基中无机氮、有机氮含量以及添加PEG对愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力的影响，为稀缺大麦资源的种质繁殖和创造同一亲本来源的群体遗传材料提供途径，以更好地开展相关遗传机理研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为大麦(HordeumvulgareL.)品种花30经小孢子培养获得的加倍单倍体株系(编号6-3)的7株小孢子再生植株(编号6-3-1、6-3-4、6-3-6、6-3-7、6-3-10、6-3-20、6-3-23)及6-3-6的4株小孢子再生植株(编号6-3-6-2、6-3-6-4、6-3-6-10、6-3-6-11)。

1.2 方法

1.2.1 植株培养与取材

11株材料用盆钵种植于人工气候室，光照强度25 μmol·m-2·s-1，光暗比12/12，温度22 ℃/18 ℃,湿度70%。参照郭桂梅等[5]的方法，调节水、肥、温度等，促进植株分蘖，以获得足够多的穗子进行小孢子培养。选取穗中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，剪去叶片(保留上部两片叶子基部约1.5 cm)，湿纱布包裹放入保鲜袋中，标号，5 ℃冰箱低温处理。

1.2.2 小孢子培养

将1.2.1中低温处理的穗子参照陆瑞菊等[10]和Lu等[4]方法进行小孢子游离。接种时，穗子的灭菌参照郭桂梅等[11]方法。每个试管接5个穗子的花苞，加入12 mL提取液(60 g·L-1甘露醇、1.1 g·L-1CaCl2、0.976 g·L-1MES、20 mg·L-1秋水仙碱，pH 5.8，下同)，用高速分散器以15 000 r·min-1旋切，150目筛网过滤，滤液700 r·min-1离心5 min，重复3次，收集小孢子。收集到的小孢子用提取液于25 ℃暗处理2 d后，用21%麦芽糖纯化；诱导培养基洗涤1次，用其将小孢子密度调节至1.0×105个·mL-1。取1.0 mL小孢子悬浮液接种于培养皿(35 mm×12 mm)中，Parafilm封口，25 ℃暗培养19 d后将诱导培养基吸干，称重愈伤组织；然后将其转入分化培养基，25℃、12 h光照培养，待再生苗长至3 cm左右进行绿苗数目统计。正常的诱导培养基以N6为基本培养基，其中，KNO3和(NH4)2SO4含量降低一半[KNO3降低至1 415 mg·L-1，(NH4)2SO4降至231.5 mg·L-1]，铁盐加倍，并添加90 g·L-1麦芽糖、0.5 mg·L-1KT、1.0 mg·L-12,4-D、0.976 g·L-1MES、400 mg·L-1谷氨酰胺及100 mg·L-1水解干酪素，pH 5.8。分化培养基是以2/3MS为基本培养基，添加30 g·L-1麦芽糖、0.5 mg·L-16-BA、1.5 mg·L-1KT及0.05 mg·L-1NAA，用5.5 g·L-1琼脂粉固化， pH 5.8。提取液和诱导培养基为过滤灭菌，分化培养基为0.11 Mpa、121 ℃高温高压灭菌15 min。

1.2.3 愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力的条件优化

将不同单株(6-3-4、6-3-6、6-3-10、6-3-23)的离体穗进行不同时间(19 d 和32 d)的5℃低温预处理后进行小孢子培养(同1.2.2)；将不同单株(6-3-10、6-3-20、6-3-23)的离体小花用提取液5 ℃预处理0 d、1 d和2 d后进行小孢子培养(同1.2.2)，测定其产生的愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力，研究低温预处理时间和离体小花提取液预处理时间对愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力的影响。

将6份单株材料(6-3-1、6-3-4、6-3-6、6-3-7、6-3-20、6-3-23)的穗子按照1.2.2方法置于5 ℃冰箱预处理19 d进行小孢子培养，诱导培养基分为正常培养基和1/2无机氮培养基，其中后者是在正常诱导培养基的基础上将KNO3和(NH4)2SO4再降低一半[KNO3降低至707.5 mg·L-1，(NH4)2SO4降至115.75 mg·L-1]；愈伤组织称重后放入相同的分化培养基进行分化，统计绿苗产量。同时将其中的4份单株材料(6-3-4、6-3-7、6-3-20、6-3-23)的小孢子置于1/2无机氮培养基和添加了1 600 mg·L-1谷氨酰胺及400 mg·L-1水解干酪素的1/2无机氮培养基上(有机氮提高4倍)进行培养，统计愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力， 研究无机氮和有机氮对愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力的影响。

将4份单株材料(6-3-6-2、6-3-6-4、6-3-6-10、6-3-6-11)的小孢子置于正常诱导培养基和添加了4%PEG的培养基上进行培养，分化培养基同1.2.2，统计愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力，研究PEG对此三个指标的影响。

1.2.4 测定项目及方法

愈伤组织产量：每皿小孢子培养19 d时产生的愈伤组织量，用mg·皿-1表示； 绿苗产量：每皿愈伤组织分化出的绿苗数，用株·皿-1表示；再生能力：每100 mg愈伤组织分化出的绿苗数，用株·100 mg-1愈伤组织表示。

1.3 数据处理

采用Excel 2010、DPS V7.05进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 离体穗5 ℃处理时间对愈伤组织产量、绿苗产量及再生能力的影响

从表1可以看出，单株6-3-10预处理32 d的愈伤组织产量和绿苗产量高于预处理19 d，而其他3份单株都是预处理19 d的效果优于32 d，其中，6-3-4和6-3-6差异达显著水平。低温预处理时间从19 d增加到32 d，所有供试单株的再生能力均下降，4份供试单株中，3份单株的再生能力在处理间差异显著。6-3-23变幅最大，预处理19 d 时的愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力分别是预处理32 d的1.41倍、6.75倍和4.75倍。

* 和 ** 分别表示预处理32 d与19 d间差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

* and ** mean significant difference between the pretreatments at 19 d and 32 d at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.2 离体小花提取液预处理时间对愈伤组织产量、绿苗产量及再生能力的影响

从表2可以看出，提取液预处理时间对6-3-20的愈伤组织产量无显著影响，对其绿苗产量、再生能力及其他材料的愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力均有显著影响，且均随着处理时间的延长而增加(6-3-10的愈伤组织除外)，不同处理间差异均达显著水平(6-3-10除外)。单株6-3-10的离体小花培养的愈伤组织与绿苗情况见图1A和B。

同行数据后不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。表3～5同。

Different letters following data in same row mean significant difference between treatments at 0.05 level.The same in tables 3-5.

2.3 诱导培养基中无机氮含量对愈伤组织产量、绿苗产量及再生能力的影响

从表3可以看出，6份单株材料经低无机氮的诱导培养基处理后，愈伤组织产量、绿苗产量和再生能力均高于对照，其中，3份单株材料的愈伤组织在处理间差异显著；6份材料的绿苗产量在处理间差异均显著，增加幅度最大的是6-3-20(图1C)，达到8.63倍，增加幅度最小的6-3-23，为1.53倍。5份材料的再生能力在处理间差异显著。这些结果表明，诱导培养基中无机氮的降低，有利于胚性愈伤组织的形成，使得更多的愈伤组织能够在分化培养基上形成绿苗。

2.4 诱导培养基中有机氮含量对愈伤组织产量、绿苗产量及再生能力的影响

从表4可以看出，诱导培养基中有机氮含量提高后，4份单株材料的愈伤组织产量和绿苗产量均显著增加，再生能力在处理间差异不显著；绿苗产量与愈伤组织产量的提高幅度相当。推测有机氮的提高使得更多的小孢子脱分化启动形成愈伤组织(图1D)，进而增加绿苗的数量。

A和B：小花预处理0 d、1 d、2 d的愈伤组织与绿苗；C：对照与处理(1/2无机氮)绿苗长势；D：对照与处理(增加有机氮)愈伤组织。

A and B:Callus and green plants with floret nursing in extraction buffer；C:Green plants in normal and low inorganic nitrogen；D:Callus in normal and high organic nitrogen.

图1大麦单株小孢子培养的愈伤组织与植株分化

Fig.1Callusgreenplantofbarleymicrosporeculturefromsingledonorplant

表3 无机氮对愈伤组织产量、绿苗产量及再生能力的影响Table 3 Effect of inorganic nitrogen on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

表4 有机氮对愈伤组织产量、绿苗产量及再生能力的影响Table 4 Effect of organic nitrogen on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

2.5 诱导培养基中添加PEG对愈伤组织产量、绿苗产量及再生能力的影响

从表5可以看出，PEG的添加对供试单株的愈伤组织产量影响不尽相同，除单株6-3-6-10降低外，其余3株均提高，但仅6-3-6-2提高显著；PEG的添加使所有单株的绿苗产量均提高，且除单株6-3-6-4外均达显著水平；所有单株的再生能力在添加PEG后均显著提高。

表5 PEG对愈伤组织产量、绿苗产量及再生能力的影响Table 5 Effect of the addition of PEG on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

3 讨 论

在早期的花药培养研究中，离体穗的低温预处理和花药的甘露醇预处理被广泛应用于大麦花药培养。虽然直接游离大麦小孢子也能获得再生植株[12]，但是离体穗的低温预处理有助于游离小孢子的脱分化启动[13-15]，甘露醇(提取液主要成分)预处理的培养效果也得到证实[16]。这种简单易行且非常有效的预处理方法在大麦、青稞和水稻的小孢子培养上同样被广泛采用[7,17-18]。本研究以大麦小孢子培养的单株为取材对象，比较了离体穗5 ℃处理19 d和32 d的培养效果，发现离体穗经过19 d的低温预处理后，小孢子更容易启动脱分化程序，且形成的愈伤组织质量好，具有更大的绿苗分化潜力，但这种效果会随着供试单株不同而有所差异。小花或未成熟子房的共培养，可以促进小孢子胚胎的发生[4,19-20]。本研究发现，在小孢子游离前用提取液预处理小花1～2 d，也可以促进小孢子胚胎的发生，进而促进愈伤组织的形成和绿苗的分化。

培养基的选择是植物离体培养中最能体现人为调控作用的因素之一，培养基中氮源的重要性在大麦花药培养上早已证实。早期的工作以MS培养基和略作修改的MS培养基最普遍，后来N6、C17和W14培养基的发明及应用极大地推动了禾本科植物组织培养和花药培养的进步[21-22]。将MS培养基中NH4NO3含量降低至165 mg·L-1对大麦花药培养的成功至关重要[23]，培养基中无机氮源的影响在大麦小孢子培养上早已证实[7,9,24]。但有机氮的作用有争议，有研究认为，培养基中添加谷氨酰胺会使白苗的数量大幅度增加[25]；谷氨酰胺的添加对水稻愈伤诱导具有基因型的选择，而且不能够提高植株的再生频率[26]。也有研究表明，培养基中添加谷氨酰胺能够促进水稻愈伤的诱导以及绿苗再生[27]；水解干酪素的添加能够提高大麦花药培养中绿苗率，降低白苗的数量[28]。本研究结果表明，适当降低诱导培养基中无机氮含量[KNO31 415～707.5 mg·L-1，(NH4)2SO4231.5～115.5 mg·L-1]，能显著提高单株小孢子培养绿苗产量，诱导培养基中有机氮源含量提高，可以大幅度提高大麦小孢子离体培养的愈伤组织产量，从而提高绿苗产量。

PEG作为渗透胁迫物质可以对植物造成水分胁迫，因而被广泛应用于植物抗旱性鉴定研究。有研究表明，在诱导培养基中加入较低浓度的PEG(80～100 mg·L-1)，可以提高小麦花药培养的出愈率，PEG浓度达到120 mg·L-1时对供试材料的花药出愈起到胁迫作用，在小麦的花药培养中，供试材料整株水平的抗旱性与细胞水平的抗旱性存在着内在的关系[29-30]。小孢子培养必须采用液体培养方式，而通气差是液体培养的致命缺点。为了改善液体培养基中的通气条件，有研究表明，诱导培养基中添加Ficoll能提高绿苗得率[31]，不过Ficoll比较贵，在以育种为目的的小孢子培养中不常使用。我们在本试验中观察到，诱导培养基中添加了4%的PEG后，培养的小孢子很多呈漂浮状态，而对照培养基中小孢子一般都下沉在培养皿的底部。因此，推测PEG的作用类似Ficoll，通过改善通气条件使得愈伤组织的质量有了提高，从而提高了愈伤组织的绿苗再生能力，使绿苗产量有了大幅度提高。