1BL/ 1RS易位系HMW-GS组成与品质分析

李亚青，张 楠，张士昌，何明琦，李孟军

(石家庄市农林科学研究院/河北省小麦工程技术研究中心，河北石家庄 050041)

1BL/1RS易位系是由黑麦的1RS染色体短臂取代普通小麦的1BS染色体短臂形成的，1BL/1RS易位广泛存在于世界各地的小麦基因组中，在我国小麦育种和生产中也占有重要的地位[1-3]。黑麦1RS染色体短臂替代小麦1BS 染色体短臂给小麦带来抗逆性、丰产性和稳产性的同时，也导致其烘烤加工品质变差，主要表现为面团粘性增加、面筋强度减弱、面团形成时间显著变短、最大抗延阻力降低、面团延伸性增加和面包体积减小等[4-5]。1BL/1RS易位使 1BS上编码低分子量麦谷蛋白亚基的位点Glu-3和编码γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的位点Gli-1丧失，导入了1RS 上编码γ-黑麦碱和ω-黑麦碱的Sec-1位点。Sec-1位点编码的γ-黑麦碱、ω-黑麦碱不能补偿Glu-3、Gli-1编码的低分子量麦谷蛋白和γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的品质效应，引起麦谷蛋白聚合物结构的改变和数量的减少，给1BL/1RS 易位系的SDS 沉降值、和面时间、面团延伸性、耐揉性和抗延阻力等加工品质性状带来显著负面效应[4,6-7]。Sec-1位点编码的ω-黑麦碱高度亲水，致使面团的吸水性增大，持水性降低，面团的稳定性和延伸性降低，从而导致1BL/1RS 小麦烘烤和蒸煮品质下降[8-9]。因此，消除ω-黑麦碱的不良影响是解决1BL/1RS易位系小麦面团不良加工品质的重要途径之一。解决ω-黑麦碱对面团加工品质不良影响途径主要包括：(1)导入优质HMW-GS。优质HMW-GS的导入可在一定程度上弥补由ω-黑麦碱基因造成的不良影响[10]。(2) 用1BS上含有Glu-3位点和Gli-1位点的区段置换1RS上含有Sec-1位点的区段。这种策略周期长、花费大，被置换的黑麦的染色体区段可能包括一些对其他性状有益的基因。(3) 利用转基因技术沉默ω-黑麦碱基因家族。ω-黑麦碱基因沉默的转基因株系的面筋指数、沉降值和面团稳定时间均显著提高，而其农艺性状，如株高、穗粒数、千粒重和小区产量均未受到不良影响[11]；这种策略存在转基因后代沉默性状是否多代稳定遗传以及转基因小麦在育种和生产上无法推广的问题。(4)利用诱变技术敲除1RS上含有Sec-1位点的区段。本课题组利用A-PAGE技术筛选石麦15重离子束诱变的突变体库，获得了ω-黑麦碱缺失突变体株系A94；石麦15的面团稳定时间为1.2～1.4 min，而株系A94的面团稳定时间为3.0～3.2 min。

本研究利用SDS-PAGE技术对300份1BL/1RS小麦易位系材料的HMW-GS组成进行解析，并采用DA7200近红外成分分析仪对其籽粒主要品质性状进行测定，以深度挖掘1BL/1RS易位系的育种潜力，明确优质HMW-GS对小麦加工品质的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)技术从石家庄市农林科学研究院小麦所马兰试验站和河北省农林科学院小麦资源室保存的1 850份小麦品种(系)中鉴定出1BL/1RS易位系482份。在石家庄市农林科学研究院院部试验地对482份材料连续进行了4年(2011-2015年)农艺性状观察和纯系选择，选取在该地区田间表现良好的300份材料进行HMW-GS组成与品质分析。

1.2 小麦1BL/1RS易位系鉴定

采用A-PAGE技术和分子标记技术对供试材料进行鉴定[12-14]。1RS特异性引物AF1/AF4和1BS特异性引物GluB3见表1。PCR 反应体系(20 μL)：2×Taq PCR StarMix(GenStar)10 μL，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板基因组DNA 2 μL(50 ng·L-1)，ddH2O 6 μL。 PCR扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,退火 30 s,72 ℃ 2 min/1min，35个循环。Taq Polymerase 为2×Taq PCR StarMix(GenStar)。

1.3 小麦HMW-GS组成和品质分析

每个小麦品种的HMW-GS蛋白提取及其SDS-PAGE分析参照魏 乐、朱金宝和 Morel等[15-17]的方法。每个材料取3粒种子分别磨碎，加入200 μL蛋白提取液(0.062 5 mol·L-1Tris-HCl，pH 6.8，5% 巯基乙醇，2% SDS,20%丙三醇，0.002%溴酚蓝)，过夜后沸水浴2 min,12 000 r·min-1离心5 min，取上清备用。电泳采用不连续缓冲系统，分离胶浓度8.7%，浓缩胶浓度4.8%，交联度均为2.67%；缓冲液:25 mmol·L-1Tis-HCl，192 mmol·L-1甘氨酸，0.1%SDS，pH 8.8；100 V恒压电泳，溴酚蓝移动至凝胶底部，停止电泳，染色过夜(10%冰醋酸，25%乙醇，0.01%考马斯亮蓝R250)。脱色(10%冰醋酸，25%乙醇)至蛋白条带清晰，照相保存。

表1 1BL/1RS易位系检测引物Table 1 Primers for identification of 1BL/1RS translocation wheat accessions

亚基命名参照Payne 和Lawrence[18]的命名系统。采用DA7200近红外成分分析仪对小麦籽粒主要品质进行测定[19-20]。

1.4 数据处理

应用Excel 2013软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 1BL/1RS易位系鉴定

黑麦醇溶蛋白电泳谱上1RS 有1组特征带，此特征带为Gli-B1l位点的表达产物[21]，因此小麦醇溶蛋白Gli-B1l可作为1RS/1BL易位系的标记[22]。A-PAGE电泳图谱显示，300份小麦材料醇溶蛋白ω区均具有1RS Gli-B1l特征条带(图1)。用引物AF1/AF4在300份材料中均可扩增出1 500 bp条带，用引物GluB3未扩增出相应条带出现。推测300份材料均具有黑麦1RS染色体，均为1BL/1RS 易位系。

A:醇溶蛋白A-PAGE电泳；B:1RS特异引物AF1/AF4 PCR扩增；C:1BS特异引物GluB3 PCR扩增；M:DNA marker DL2000；1:山农914453；2:河农6049；3:邯早1号；4:邯原1号；5:冀曲麦12；6:莱州3279；7:莱州137；8:石新731；9:金丰4198；10:石麦18；11:石麦15；12:藳优2018；13:师栾02-1；14:ddH2O

A:Gliadins separated on A-PAGE; B:PCR products amplified with 1RS specific primer AF1/AF4; C:PCR products amplified with 1BS specific primer GluB3；M:DNA marker DL2000; 1:Shannong 914453; 2:Henong 6049; 3:Hanzao 1; 4:Hanyuan 1; 5:Jiqumai 12; 6:Laizhou 3279; 7:Laizhou 137; 8:Shixin 731; 9:Jinfeng 4198; 10:Shimai 18; 11:Shimai 15; 12:Gaoyou 2018; 13:Shiluan 02-1; 14:ddH2O

图11BL/1RS易位系小麦鉴定

Fig.1Identificationof1BL/1RStranslocationwheataccessions

2.2 HMW-GS分析

在300份1BL/1RS易位系中检出12种HMW-GS类型。Glu-A1位点检出2种亚基(Null、1)，Null和1亚基出现频率分别为47.67%和52.33%；Glu-B1位点检出7种亚基类型(6+8、7、7+8、7+9、13+16、14+15、17+18)，以7+9亚基频率最高，达到58.67%，优质亚基7+8、14+15和17+18的频率分别为11.00%、17.00%和9.67%；Glu-D1位点检出3种亚基类型(2+12、5+10、5+12)，2+12亚基出现的频率最高，为71.33%；优质亚基5+10和5+12的频率分别为16.00%和12.67%(表2)。

300份1BL/1RS易位系中检出27种HMW-GS组合。组合Null/7+9/2+12的频率最高，为31.67%；其次是组合1/7+9/2+12，频率为16.00%；组合1/14+15/2+12的频率为8.67%，其余24种组合出现的频率均小于5%。从沉降值、烘烤品质和面团强度等方面考虑，在27种HMW-GS组合中有4种优质亚基组合，分别为1/7+8/5+10、1/7+9/5+10、1/14+15/5+10、1/17+18/5+10[23-25]。具有这4种优质亚基组合的1BL/1RS易位系共有31份，出现频率为10.33%(表3)。300份1BL/1RS易位系的HMW-GS类型丰富，其亚基组合也呈现出较高的多态性。

表2 1BL/1RS易位系 Glu-1位点HMW-GS组成与频率Table 2 Composition and frequencies of HMW-GS encoded by Glu-1 loci in 1BL/1RS translocation lines

表3 1BL/1RS易位系HMW-GS组合及频率Table 3 Composition and frequencies of HMW-GS in 1BL/1RS translocation wheat accessions

2.3 品质性状

300份1BL/1RS易位系的品质性状呈现出明显差异。延展性、蛋白质含量、湿面筋含量、硬度和沉降值5项指标的变异系数较大，其中，沉降值变异系数最大，为20.70%；容重的变异系数最小，仅为1.16%(表4)。

表4 1BL/1RS易位系的品质性状Table 4 Quality performance of 1BL/1RS translocation wheat accessions

小麦烘焙品质与蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值正相关[25-26]。进一步结合HMW-GS组成分析，在300份易位系中有9份有较高的品质育种价值(表5)，其HMW-GS组合均为优质亚基组合，其中5份的亚基组合为1/7+8/5+10，4份的亚基组合为1/7+9/5+10。 临远3158、寒24和烟农18的蛋白质含量分别为11.82%、11.88%和12.17%，蛋白质含量基本达到弱筋小麦标准。这9份材料为1BL/RS易位系在育种中的应用提供了新的候选亲本。

表5 优良1BL/1RS种质资源Table 5 Germplasms of 1BL/1RS translocation wheat accessions with good quality

3 讨 论

1BL/1RS的1RS不但具有抗条锈病(Yr9)、叶锈病(Lr26)、秆锈病(Sr31)和白粉病(Pm8)基因[1],而且携带提高小麦产量和增强对环境适应性的基因，因此1BL/1RS易位系在小麦抗病、抗逆和产量等方面显示出独特的优越性[1-2]。但是，Sec-1位点的引入和Glu-3、Gli-1位点的缺失，导致1BL/1RS易位系加工品质下降[4-7]。近年来，在小麦育种中对品质的重视程度不断提高，1BL/1RS易位系在小麦育种中的利用受到很大的限制。为了更好利用1BL/1RS易位系，挖掘其育种潜力，有必要对现有的1BL/1RS易位系资源进行深入研究，寻找在小麦品质育种具有应用价值的1BL/1RS易位系。

HMW-GS的组成与小麦面粉的理化性质如弹延性及沉淀值等密切相关[18]。优质HMW-GS组合可以补偿1RS上Sec-1表达的ω-黑麦碱造成的小麦加工品质的降低[10]。因此，检出具有优质亚基组合的1BL/1RS易位系，并进一步分析其品质及其遗传规律，有助于促进1BL/1RS易位系在小麦品质育种中的应用。普通小麦1AL、1BL 和 1DL 上分别具有Glu-A1、Glu-B1和Glu-D13个编码 HMW-GS 的基因位点，统称为Glu-1[18]。亚基1、2*、7+8、7+9、13+16、14+15、17+18和5+10对小麦加工品质有正向效应，属于优质亚基[23-25]。本研究中，1BL/1RS易位系Glu-A1位点编码2种HMW-GS，其中优质亚基1占比为52.33%；Glu-B1位点编码 8种亚基组合，其中4种优质亚基(7+8、13+16、14+15、17+18)总计占比38.34%；Glu-D1位点编码4种HMW-GS，其中优质亚基5+10占比16.00%。在300份1BL/1RS易位系中，有31份在3个位点上均编码优质亚基，但其品质呈现明显差别，其中仅9份表现较好。亚基组成相同的小麦品种品质有较大差异,这说明小麦品质除了与亚基组成有关外,还受亚基含量等其他因素的影响[27]。1BL/RS易位系的品质性状及其品质育种价值有待更深入研究。

本研究中，300份1BL/1RS易位系容重和吸水率的变异系数较小，而其他5项指标的变异范围较大。郑91138、淮麦0606、嘉麦4号、陕农78、济997884、烟2801、烟0401、邯优1号和沧麦028 有较高的品质育种价值。这些材料Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点均编码优质亚基，同时具有较好的蛋白质品质。