谷胱甘肽过氧化物酶1 在肝癌组织中的表达及其意义的 生物信息学分析

王烁，陈波，苗雄鹰

（中南大学湘雅二医院 普外肝胆专科，湖南 长沙 410011）

肝细胞癌（以下简称肝癌）是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]，它以恶性程度高，浸润性和转移性强，预后差，严重威胁人民健康，随着医疗技术的不断发展，肝癌治疗已发展为多学科综合治疗模式[2-3]，其有效治疗的可能性很大程度上取决于症状发生前早期的检测[4]。目前已有研究表明谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione peroxidase 1，GPX1）在乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌等肿瘤组织中表达上调，可能有利于肿瘤的进展和扩散[5-6]，但是GPX1在肝癌中的研究较少，尚无研究系统全面分析其在肝癌中的临床价值，而实现肝癌的早期诊断对于肝癌的有效治疗和改善预后非常重要，通过基因技术手段进行肿瘤分子标志物的筛选和基因治疗，是目前治疗肝癌的研究方向和热点。

GPX1基因位于染色体3p21上，表达产物主要存在于氧张力较高的组织中如肺、肝、肾等[7]。GPX1在过氧化氢的解毒中起作用，是人体最重要的抗氧化酶之一。这种蛋白是高等脊椎动物中仅有的几种含有硒半胱氨酸的蛋白之一。此外，该蛋白在N端区域以多丙氨酸序列多态性为特征，该序列中包括3 个具有5、6 或7 个丙氨酸重复序列的等位基因。GP X1 的主要功能是降解活性氧（ROS），保护细胞免受氧化应激[8-9]，而ROS在肿瘤的发生发展过程中起到了重要的推动作用。相比正常细胞肿瘤细胞内存在更高水平的ROS[10]，肿瘤细胞可通过多种途径产生过量的ROS[11-12]。过量的ROS能够刺激肿瘤细胞发生、增殖、侵袭、迁移及血管生成，且能够启动逃避凋亡的机制，并诱导化疗药物耐药性的产生，涉及的相关机制包括导致点突变，活化原癌基因、促进上皮间充质转化、介导间质结构破坏、血管内皮细胞通透性增强、刺激缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-lα）表达等[13-14]。

目前GPX1在肝癌中的研究较少，尚无研究对其在肝癌中的临床价值进行系统全面的分析，因此，本研究旨在通过生物信息学的方法分析GPX1在肝癌中的表达情况以及GPX1对肝癌早期筛选、预后的价值。

1 资料与方法

1.1 数据来源

从Ualcan数据库（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）获取50例正常肝组织及371例原发性肝癌组织的G PX 1 表达数据。肝癌组织中I期168例，II期84例，III期82例，IV期6例；男245例，女117例；21～40岁27例，41～60岁140例，61～80岁181例，81～100岁10例。部分患者无法准确分期或缺性别信息，以及＜20岁和＞100岁的患者例数过少均未纳入统计。

1.2 研究方法

分析肝癌组织与正常组织及肝癌患者不同分期、性别、年龄不同分组间GPX1的表达差异，并于LinkedOmics数据库（http://www.linkedomics.org）中检索GPX1共表达基因，得出与GPX1正相关及负相关表达基因热图，同时对共表达基因做GO 富集分析、KEGG 通路分析，并基于STRING10.5（https://string-db.org）进行相关基因编码蛋白的相互作用网络分析。最后基于GEPIA数据库数据（http://gepia.cancer-pku.cn）分析GPX1与肝癌患者总体生存率（OS）、无病生存时间（DFS）的关系，绘制GPX1表达水平与预后生存曲线。

1.3 统计学处理

GPX1的表达水平经四分位数分成四等份并分别绘制成箱线图进行比较，数据以中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示，采用秩和检验。GEPIA数据库使用Kaplan-Meier生存分析法来计算生存时间及生存率并绘制OS及DFS曲线，采用Log-rank检验比较不同表达水平的生存差异从而得出P值。

2 结 果

2.1 GPX1 在肝癌与正常肝组织中表达情况

Ualcan数据库中50例正常肝组织GPX1表达水平为266.211（231.986，316.004）；371例肝癌组织中GPX1表达水平为446.254（325.771，637.913）。肝癌组织中GPX1表达水平明显高于正常肝组织（P＜0.05）（图1）。

图1 肝癌与正常肝组织GPX1 表达水平Figure 1 GPX1 expression levels in liver cancer and normal liver tissues

2.2 GPX1 在肝癌不同分期中表达情况

Ualcan数据库中168例I期肝癌组织中GPX1表达水平为418.032（319.815，608.761）；84例II期肝癌组织中GPX1表达水平为527.488（406.292，708.117）；82例III期肝癌组织中GPX1表达水平为396.883（292.728，586.859）；6例IV期肝癌组织中GPX1表达水平为571.242（536.796，719.670）。I、II、III期肝癌组织中GPX1表达水平均明显高于正常肝组织（均P＜0.05），而IV期肝癌组织中GPX1表达水平与正常肝组织差异无统计学意义（P=0.09）。各期肝癌组织组中GPX1表达水平两两比较结果显示，II期肝癌组织GPX1表达水平高于I期肝癌组织（P＜0.01），其余各分期之间GPX1表达水平无统计学差异（均P＞0.05）（图2）。

图2 不同分期肝癌GPX1 表达水平Figure 2 GPX1 expression levels in liver cancer tissues of different stages

2.3 GPX1 在肝癌不同性别分组中表达情况

Ualcan数据库中245例男性肝癌患者肝癌组织中GPX1表达水平为477.440（333.705，689.337）；117例女性患者肝癌组织中GPX1表达水平为418.591（269.648，524.148）。男性肝癌患者肝癌组织中GPX1表达水平明显高于女性肝癌患者（P=0.02）（图3）。

2.4 GPX1 在肝癌不同年龄分组中表达情况

Ualcan数据库中27例21～40岁患者肝癌组织中GPX1表达水平为396.302（257.820，578.551）；140例41～60岁患者肝癌组织中GPX1表达水平为420.743（286.715，651.264）；181例61～80岁患者肝癌组织中GPX1表达水平为469.043（356.222，652.360）；10例81～100岁患者肝癌组织中GPX1表达水平为443.651（314.771，506.432）。各年龄段患者肝癌组织GPX1表达水平均明显高于正常肝组织（均P＜0.05）。尽管GPX1的表达水平随着年龄的增加有升高趋势，但是各年龄组之间GPX1表达水平无统计学差异（P＞0.05）（图4）。

图3 不同性别肝癌患者GPX1 表达水平Figure 3 GPX1 expression levels in liver cancer tissues from patients of different sexes

图4 不同年龄肝癌患者GPX1 表达水平Figure 4 GPX1 expression levels in liver cancer tissues from patients of different ages

2.5 GO 富集分析

于LinkedOmics中检索到3 061个与GPX1共表达基因，对相关系数＞0.3的共表达基因进行分析，GO 富集结果发现，这些共表达基因主要集中转录、翻译、蛋白泛素化、蛋白质磺酰化等生物学过程（表1）；细胞质、细胞核仁、中心体、蛋白酶体复合体等细胞成分（表2）；RNA结合、蛋白质结合、癌基因结合蛋白、螺旋酶活性等分子功能（表3）。

表1 生物学过程Table 1 Biological process

表2 细胞成分Table 2 Cellular component

表3 分子功能Table 3 Molecular function

2.6 KEGG 通路分析

KEGG通路分析结果显示这些基因明显富集于TGF-β信号通路、MAPK信号通路、HIF-1α信号通路、NF-κB信号通路、VEGF信号通路、Notch信号通路、RAS信号通路及各种癌症（胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、小细胞型肺癌、非小细胞型肺癌、甲状腺癌、阿尔兹海默症、非酒精性脂肪肝、乙肝病毒性肝炎、急性髓样白血病）途径明显有关（均P ＜0.0 5）（表4）。

表4 通路分析 Table 4 Pathway analysis

2.7 GPX1 共表达基因热图

检索LinkedOmics中与GPX1相关的共表达基因，根据与GPX1表达的相关性绘制出共表达基因热图（图5）。

图5 共表达基因热图 A：正相关基因；B：负相关基因Figure 5 The heat maps of the co-expressed genes A: Positively correlated genes; B: Negatively correlated genes

2.8 编码蛋白相互作用网络分析

STRING 10.5 数据库检索GPX1相关基因，结果显示谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GSR）、超氧化物歧化酶1 ～3（superoxide dismutase SOD 1-3）、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）、谷胱苷肽S-转移酶类（glutathione S-transferase theta pseudogene 1，GSTT1P；glutathione S-transferase theta 2B，GSTT2B；glutathione S-transferase pi，GSTP1；glutathione S-transferase mu 1，GSTM1）、造血前列腺素D合成酶（hematopoietic prostaglandin D synthase，HPGDS）等10个肝癌相关基因编码的蛋白与GPX1所编码的蛋白存在相互作用关系（图6）。

2.9 GPX1 表达与肝癌预后的关系

利用GEPIA数据库绘制出GPX1表达水平与肝癌患者预后生存曲线图，分析GPX1表达水平与OS、DFS之间的关系。结果显示，GPX1高表达患者OS、DFS均明显低于GPX1低表达患者（P=0.048、P=0.035）（图7）。

图6 肝癌相关基因编码的蛋白与GPX1 所编码的蛋白网络Figure 6 Interaction network of the proteins encoded by liver cancer related genes and GPX1

图7 不同GPX1 表达情况患者生存曲线Figure 7 Survival curves of patients with different GPX1 expression profiles

3 讨 论

本研究结果显示，肝癌组织中GPX1表达水平高于正常肝脏组织。I、II、III期肝癌组织中GPX1表达水平均高于正常肝组织，而IV期肝癌组织GPX1表达水平与正常肝脏组织表达水平无统计学差异，考虑出现该现象的原因可能为晚期肿瘤组织多伴有坏死、机化，局部氧化应激反应相对早、中期肝癌减少，遂与氧化应激反应相关的GPX1表达水平亦随之下降。I期肝癌组织中GPX1表达水平与II期肝癌组织有统计学差异，表现为 II期肝癌组织GPX1表达水平高于I期肝癌组织，其余各分期之间GPX1表达水平无统计学差异。肝癌患者中男性患者GPX1表达水平较女性患者更高。不同年龄患者肝癌组织GPX1表达水平高于正常患者GPX1表达水平，尽管随着年龄的增加，GPX1的表达水平逐渐升高，但是各年龄组之间GPX1表达水平无明显统计学差异。GPX1高表达患者OS、DFS均低于GPX1低表达患者。

Zhao等[15]分析了肝癌细胞和正常肝细胞之间GPX1的表达情况，结果表明，人肝癌HepG2细胞中GPX1上调，提示该基因可能在肝癌发生的发生和发展中起重要作用。Su等[16]发现了增加的氧化剂负担与肝癌发生有关，并且抗氧化酶抵消潜在的氧化损伤。因此，编码抗氧化酶的基因中的GPX1可能在肝癌的发展中起重要作用。影响肝癌预后的因素很多，大致可分为患者因素、肿瘤本身因素、治疗相关因素等几大类[17]，所以分析肝癌发生发展的机理及参与的多个通路非常重要，这可以为肝癌的治疗靶点提供新的方向。GO富集及KEGG通路分析发现GPX1共表达基因主要参与基因转录、翻译、蛋白泛素化、蛋白质磺酰化、mRNA稳定性调节、蛋白酶体核复合体、线粒体翻译等分子生物学过程，并参与TGF-β、mTOR、WNT、MAPK、HIF-1α、NF-κB、VEGF、Notch等信号通路及各种癌症疾病通路发生过程。TGF-β信号通路在肝脏肿瘤中起着重要和复杂的作用，这些包括许多不同的功能，如维持干细胞内稳态、促进纤维化、免疫调节、作为肿瘤抑制物和矛盾地作为肿瘤进展物[18-19]。RAS/MAPK信号通路在大多数肝癌患者中被激活，并且与预后不良相关，肝癌Ras通路异常激活的主要细胞内机制及其潜在的治疗意义，RAS/MAPK通路效应被认为可能是肝癌的潜在治疗靶点[20]。肝癌的发病机制与肝细胞持续死亡、炎性细胞浸润和代偿性肝再生密切相关，NF-κB信号通路在发育和成年肝脏中均可促进肝细胞存活，它还通过控制一系列生长因子和细胞因子的表达，在肝脏炎症反应中发挥关键作用，该信号通路也有作为治疗靶点的潜力[21-22]。HIF-1α和VEGF在原发性肝癌组织中的mRNA和蛋白水平均有较高的表达，HIF-1α和VEGF的表达与肿瘤分期、淋巴结转移和肺转移相关。HIF-1α在原发性肝癌中的表达与VEGF表达呈正相关（r=0.665，P＜0.05）。HIF-1α和VEGF均与总生存率显著相关，而HIF-1α是独立的预后因子，HIF-1α和VEGF可作为肝癌TACE疗效和原发性肝癌转移的预测因子，是肝癌晚期的生物标志物，提示肝癌患者预后不良，HIF-1α和VEGF可能是改善原发性肝癌预后的靶点[23]。Notch信号通路在肝癌的转移、复查、预后中亦有重要作用，在肝癌组织中，Notch1高表达与肿瘤大小、分级、侵袭、转移、血管侵犯及TNM分期均显著相关[24]。此外，Notch1在肝转移癌组织中异常高表达，Notch1及其下游分子HES1在肝癌组织中均呈高表达状态[25]。

综上所述，GPX1在肝癌组织中高表达，且与肝癌的发生、发展密切相关。因此，GPX1可以作为肝癌筛选、预后预测的标志物之一。