进展性缺血性脑卒中与阿司匹林抵抗及PEAR 1基因型的相关性研究

杨阿莉 胡亚梅 向 莉 周 瑶 刘俊然

郑州大学人民医院(河南省人民医院)神经内科，河南 郑州 450003

进展性缺血性脑卒中多被定义为发病后一段时间内由进行性脑缺血所致的持续神经功能恶化，其病死率和致残率较非进展性脑卒中更高[1]。既往大量循证医学证据表明，阿司匹林的抗血小板聚集作用可以减少缺血性脑卒中的发病率、复发率和病死率。然而相当一部分患者虽坚持服用阿司匹林，仍再次甚至多次发生缺血性心脑血管事件，检测发现其血小板的活性或聚集率未得到有效抑制，此现象称为阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)[2]。AR的发生可能涉及到多种综合因素、环节的共同作用，如阿司匹林剂量不足、糖尿病、血小板对二磷酸腺苷(ADP)等聚集诱导剂的敏感性增高等，而非单一机制。目前，越来越多的研究开始重视遗传因素在AR中的作用，有资料显示血小板内皮聚集受体1(PEAR 1)基因多态性可能为AR的影响因素。本研究旨在探讨AR与进展性缺血性脑卒中的相关性及其与PEAR 1基因型的关系。

1 资料与方法

1．1研究对象纳入2016-05—2018-06住院的急性缺血性脑卒中患者236例，其中男127例，女109例，年龄36～88(68.3±11.9)岁。根据神经功能变化情况将患者分为进展性脑卒中组和非进展性脑卒中组(简称进展组和非进展组)，其中进展组54例，男30例，女24例；非进展组182例，男97例，女85例。2组分别根据血小板聚集率的高低再分为AR和AS(阿司匹林抵抗，aspirin resistance)组。所有患者接受急性脑梗死常规药物治疗。

1．2入选标准首次发病，符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》中急性缺血性脑卒中的诊断标准[3]，均为发病24 h后入院，患者及(或)家属对研究过程及注意事项等知情同意，并签署知情同意书，愿意配合治疗和观察。进展性脑卒中标准：发病7 d内斯堪的那维亚卒中量表(Scandinavian Stroke Scale，SSS)评分中的意识水平、上肢、下肢或眼球运动降低≥2分和(或)语言功能降低≥3分[4]。

1．3排除标准(1)重度(50%以上)脑动脉狭窄；(2)心脏、血管炎、血管畸形、外伤等其他因素或病因不明的缺血性脑卒中；(3)血小板计数>300×109个/L或<100×109个/L；(4)近期应用其他可能影响血小板功能的药物，如氯吡格雷、西洛他唑、潘生丁、华法令、低分子肝素等；(5)阿司匹林过敏，目前有明确活动性消化道溃疡或既往有大出血史；(6)他汀类药物不耐受，如服药后肝功能异常、肌酶升高等；(7)严重的各种血液系统病，严重的心功能、肝肾功能异常，严重的感染免疫性疾病，恶性肿瘤等；(8)有重大手术或创伤史。以上条件如果符合其中一条则不能纳入。

1．4血小板功能检测所有患者于入院后早餐前口服阿司匹林100 mg/d，连服7 d，次日清晨空腹状态时采用抗凝真空管抽取肘静脉血2.7 mL×2管，轻轻混匀后以1 000 r/min 转速离心10 min，收集上层富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，剩余样本再以4 000 r/min 转速离心10 min，收集乏血小板血浆(platelet-prro plasma，PPP)，用PPP调节PRP 至血小板计数200×109个/L～300×109个/L，将PRP和PPP分别加入两支比浊管中，在血小板聚集仪(美国Helena 公司，四通道)中调节PRP和PPP的透光度；将AA(花生四烯酸)和ADP加入到PRP中，使两者的终浓度分别为0.5 mg/mL和10 μmol/L，测定血小板聚集率。10 μmol/L ADP 诱导血小板最大聚集率≥70%以及0.5 mg/mL AA诱导血小板最大聚集率≥20%，符合上述两项条件或只符合一条均判定为AR。

1．5 PEAR1基因型测定所有患者连服7 d阿司匹林后，同时采用抗凝管留取肘静脉血做基因型测定。运用数字荧光分子杂交(digital fluorescence molecule hybridization，DFMH)技术检测PEAR1基因位点rs12041331基因型。从血液样本中收集白细胞：取1～1.2 mL 1×NH4Cl预处理液1.5 mL加入离心管中，再加入150～200 μL混匀的全血。上下颠倒混匀10次，室温环境中静置5 min，充分裂解红细胞。室温3 000 r/min离心5 min，将上层透明红色液体吸取干净，加入1 mL生理盐水或1×NH4Cl彻底重悬白细胞，室温3 000 r/min离心5 min，将上层液体吸干净。向富集有白细胞的离心管中加入30～50 μL耀金保，反复吹打混匀。室温环境中静置30 min，期间再颠倒混匀2次，待检测。向耀金分试剂中加入1.5～2 μL处理后的白细胞样本，短暂离心，上机，通过SNP检测所有患者的基因类型，基因型频率=基因型例数/总例数×100%。

1．6统计学方法应用SPSS 21.0 统计软件处理数据，计数资料采用四格表χ2检验以及二分类Logistic回归分析，计量资料先行正态性检验，认为近似正态分布后行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 2组一般情况和危险因素比较进展组糖尿病、高同型半胱氨酸以及有不稳定动脉粥样硬化斑块患者比例高于非进展组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而其他项目差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2．2 AR发生率236例患者AR患者88例(进展组33例，非进展组55例)，AS患者148例(进展组21例，非进展组127例)。进展组与非进展组相比，AR与AS患者构成比差异有统计学意义(χ2=16.994，P<0.01，表2)。AR与发病后进展呈正相关(OR=4.248，P<0.01，表3)。

2．3 PEAR 1基因不同类型分布比较PEAR 1基因型分布在进展组与非进展组间差异无统计学意义(χ2=0.095，P>0.05)，在AR组与AS组间也无明显差异(χ2=0.419，P>0.05)。见表4。

3 讨论

关于进展性脑卒中的定义，国际国内迄今均尚未达成一致意见，目前采用较多的为2004年欧洲进展性脑卒中研究组的定义：SSS评分中，与基线评分相比，发病3 d的意识水平、上肢、下肢或眼球运动降低≥2分，和(或)语言功能降低≥3分，或发病72 h内死亡[4]。国内多数临床研究中，对于进展性脑卒中的判定一般是指在一定时间窗内(多为72 h～1周内)由进行性脑缺血所导致的神经功能恶化。目前尚无循证学证据证实何种方法可明确阻止进展性脑卒中的发生和发展，本研究显示，糖尿病、高同型半胱氨酸以及不稳定动脉粥样硬化斑块等与进展性缺血性脑卒中相关，与既往研究一致[5-6]，但高龄、吸烟、高脂血症等在部分研究中证实可能相关的危险因素在2组比较中却未显示出明显差异，可能与样本量有限有一定关系。也有学者认为，虽然这些均为常见脑血管

表1 2组入院时一般情况和危险因素比较

表2 2组阿司匹林敏感性比较 [n(%)]

表3 进展性脑卒中与AR相关性分析

表 4 PEAR 1基因不同类型分布比较 [n(%)]

病危险因素，但与卒中病情进展并无明确关系，而体温升高、感染等病程中出现的并发症等与卒中病情恶化密切相关[7-9]，因而为更好地指导临床，早期预测与诊断进展性脑卒中仍需要更多的研究证据。

作为治疗和预防缺血性脑卒中的关键性药物，阿司匹林可使血小板环氧化酶(cyclooxygenase，COX)-1的丝氨酸位点乙酰化，导致COX 不可逆失活，进而阻碍血栓素(thromboxane，TXA)2与前列腺素(PGs)的生成，发挥抗血小板作用。大量基础和临床研究证明，阿司匹林能够有效抑制血小板的凝聚，进而妨碍和阻止血栓的形成[10-12]；然而从作用机制来看，阿司匹林只能对血小板聚集过程中的一个环节起作用，不可能影响和阻断急性血栓形成的整个过程，因此需要对阿司匹林是否能有效抑制血小板聚集及抑制的程度在相对客观的层面上进行评价，以便给予临床医生一定的参考。实验室AR概念是指阿司匹林不能抑制血小板活性或不能抑制依赖TXA的血小板功能，多数资料中将其定义为生化AR[13-15]。本研究应用目前应用较多的比浊法检测血小板聚集率，以此评价阿司匹林抗血小板的效果，并比较非进展性和进展性脑卒中患者AR的情况，结果显示，2组AR发生率有明显差异，且AR与进展组呈正相关，提示AR与缺血性脑卒中病情恶化有一定关系。有研究显示，AR与急性脑卒中患者临床症状程度加重和影像学梗死体积增加均相关[16-18]。然而也有研究者认为AR可能并不存在，反倒是多数受试者服用肠溶型阿司匹林后因药物吸收延迟和减少而导致“假抵抗”现象，因而临床用药剂型选择时应因需制宜[19-21]，该研究认为真正的AR很罕见，并且目前相关测试并无临床应用价值，现有的血小板功能检测可能对于发现真正的“AR”作用有限。国内也有专家认为根据血小板反应性指导临床实践为时尚早。需要注意的是，尽管几十年来就血小板功能检测在实践中的应用尤其在阿司匹林的应用进行了很多探索，但重要的指南并未明确规定将血小板测试作为一个实践参考标准。

此外，尽管对于所谓AR的研究越来越多，但该现象的确切机制尚不完全明确，有研究者提出将AR的原因归为三类。(1)临床因素：服药依从性差、生物利用度差、其他药物的相互作用、急性冠脉综合征、充血性心力衰竭、儿茶酚胺水平激增等。(2)细胞因素：COX-1的抑制不足、COX-2 mRNA的过度表达、红细胞诱导的血小板聚集、去甲肾上腺素水平升高、尿8-异前列腺素的产生等。(3)基因因素：COX-1、胶原、糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、vWF、P2Y2ADP受体的基因多态性等[22-24]。近年来，随着遗传学在各个领域的不断发展，遗传因素在AR中的作用也得到更多的研究和讨论，曾经有报道认为PEAR 1的基因多态性可能与阿司匹林抵抗相关[25-26]，然而本研究显示进展性脑卒中与非进展性脑卒中PEAR1基因型分布并无显著差异，AR与AS 2组PEAR 1基因型分布差异也无统计学意义，样本量有限可能是其中一方面原因，而既往研究中的确也有认为AR与PEAR 1、COX等的基因多态性并无关联[27]。目前对于应用阿司匹林的患者是否常规进行相关的基因检测以指导临床也尚无统一定论。AR的概念和其影响因素目前尚难以从某一方面或某几方面明确阐述，未来需要有更多的探索。

急性进展性脑卒中神经功能恶化与AR有密切关系，PEAR 1 基因型与卒中进展及AR无明确相关性。临床工作者在应用阿司匹林治疗缺血性脑卒中时，应根据实际情况及需求综合考虑选择是否进行阿司匹林敏感性及相关基因的检测。