石油烃厌氧降解基因masD和bamA实时荧光定量PCR方法的建立及应用

宋本如 甄梅楠 刘小妹 唐景春

摘 要 masD和bamA基因分别是烷烃和芳烃厌氧降解的关键基因。本研究建立了这两种基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过参考相关石油烃厌氧降解菌株的GenBank序列，利用Primer express软件设计烷烃和芳烃厌氧降解基因的扩增引物masD-f、masD-r和bamA-f、bamA-r。经过常规PCR扩增分别得到片段大小為389和354 bp扩增产物，经测序并在NCBI数据库查询，确定为masD和bamA片段。通过实时荧光定量PCR构建测定这两种基因的标准曲线。优化后的扩增体系（25 μL）为： 12.5 μL 2×Trans Start Top Green qPCR Super Mix，引物浓度为0.2 μmol/L，masD和bamA基因最适退火温度分别为52℃和56℃。建立的两种基因的实时荧光定量PCR检测方法具有非常好的重复性，其灵敏度比传统PCR技术高100倍。对于氧化石墨烯促进石油烃的厌氧降解体系中厌氧基因的定量检测显示，添加不同浓度的石墨烯均促进了bamA拷贝数的增加，但对masD的拷贝数无显著影响。

关键词 石油烃; 厌氧降解基因; masD基因; bamA基因; 实时荧光定量聚合酶链式反应

1 引 言

随着石油工业迅速发展，石油烃在土壤和水体中的污染已成为普遍的环境问题[1]。好氧生物修复被认为是修复石油烃污染的有效方法。然而，在许多被污染环境（如沉积物和地下水）中，通过提供氧气刺激微生物的生长非常困难，而且成本高昂[2]。大量研究表明，石油烃在缺氧或厌氧的环境下同样可以被兼性菌和厌氧菌降解[3]，这一新观点对于石油污染土壤、地下水及沉积物环境的原位生物修复，特别是针对一些分散的面源污染及工程修复条件较差的石油污染环境具有重要的意义。

超过半数的石油污染的主要成分是烷烃[4]。在（1-甲基烷基）琥珀酸合酶（mas）催化下的富马酸加成反应是大多数厌氧降解菌活化烷烃降解的关键步骤[5，6]。芳烃是石油污染中的重要成分，也是最常见的地下水土污染物。在厌氧环境中，大多数芳香族碳氢化合物（如苯系物、多环芳烃等）都经过微生物作用，形成中间体6-十六氧环烯基-CoA。该中间体开环反应的关键酶是由bamA基因编码的6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶[7，8]，且bamA基因在可降解芳香烃污染物的厌氧微生物中广泛存在。因此，将编码这两种关键酶的bamA基因和催化亚基masD基因作为遗传标记，为研究石油烃降解菌在厌氧环境中的分布特征和降解潜力提供了一种方法。实时荧光定量聚合酶链式反应（Real time-qPCR）是20世纪90年代中期逐渐发展起来的技术，它可以对目的基因进行定量检测，是一种快速高效、准确灵敏、方便易操作的检测方法[9，10]。SYBR Green I作为一种实时定量PCR的荧光染料，在游离状态下不发出荧光，与单链DNA基本不结合，但可与DNA双链非特异性结合，并发出荧光，具有通用性好、成本低等优点[11，12]。然而，目前实时定量PCR方法在石油烃厌氧降解方面的应用还很少[13]。

氧化石墨烯具有丰富的官能团和较高的比表面积，可以在厌氧条件下被许多微生物部分还原，可促进电子转移[14]。所有这些特征都有助于催化厌氧微生物对污染物的降解[15]。据报道，氧化石墨烯和部分还原的氧化石墨烯可促进难降解污染物的生物和非生物降解，如偶氮染料、硝基芳族化合物和卤化污染物[16，17]。但也有文献指出，氧化石墨烯能够吸附并破坏微生物的细胞壁，从而抑制微生物的生长[18]。因此，研究厌氧条件下氧化石墨烯对石油烃生物降解的影响具有重要意义。

本研究利用SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立了一种检测石油污染厌氧环境中烷烃降解基因masD及芳烃降解基因bamA的方法。优化了反应体系组成、退火温度，并以氧化石墨烯对石油烃厌氧降解影响实验为应用实例，定量检测了厌氧培养体系中烷烃和芳烃降解基因随时间的变化。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CFX96实时荧光定量PCR仪、T100梯度型PCR仪（美国Bio-Rad公司）; Nano-100微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）。DP336土壤基因组DNA提取试剂盒、DP209琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和DP302细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）; D1100质粒小量提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）; Premix Taq、RNase-Free Water（宝生物工程有限公司）; AQ131荧光定量PCR试剂盒、CT101pEASY-T1克隆试剂盒和CD501Trans-T1感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）。

2.2 引物的设计和合成

参考相关石油烃厌氧降解菌株的GenBank序列，利用Primer express软件设计出扩增引物masD-f、masD-r和bamA-f、bamA-r，可分别扩增厌氧微生物降解烷烃的关键基因（1-甲基烷基）琥珀酸合酶基因和降解芳烃的关键基因6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶基因的保守序列。引物序列、目的片段长度、理论PCR退火温度见表1。

2.3 DNA的提取及降解基因阳性模板制备

从天津市津南区污水处理厂二沉池采集厌氧活性污泥至于聚乙烯瓶中，4℃密封保存。用土壤基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行DNA检测。masD和bamA基因特异性PCR扩增的升温程序为： 94℃预变性4 min; 94℃变性30 s，masD和bamA退火温度分别为52℃和56℃保持30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR扩增体系如下： Premix Taq 12.5 μL，10 μmol/L的前后引物各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，RNase-Free Water 9.5 μL。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增特异性。扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后，连接到pEASY-T1载体上，并转化到Trans-T1感受态细胞中。通过蓝白斑筛选选取白色单菌落接种到LB培养基37℃培养24 h[21]。提取重组质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，结果在NCBI数据库查询比对。

2.4 实时荧光定量PCR反应条件优化

实时荧光定量PCR 25 μL反应体系： 12.5 μL的2×TransStart Top Green qPCR Super Mix，前后引物各0.5 μL，9.5 μL RNase-Free Water，2.0 μL经多次10倍梯度稀释的重组质粒DNA模板，同时设置无DNA模板的阴性对照。为得到最合适的引物浓度及退火温度，将实时荧光定量PCR引物最终浓度分别设置为0.1、0.2和0.4 μmol/L，将两种引物的退火温度均依次设置为48℃、52℃和56℃。实时荧光定量PCR的反应程序为： 94℃预变性30 s; 94℃变性5 s，相应引物设置的退火温度保持15 s，72℃延伸10 s， 共设40个循环。熔解曲线程序： 50℃保持5 s，然后逐渐升到95℃（增量为0.5℃/s）。

2.5 标准曲线的建立

将2 μL重组质粒滴加到微量分光光度计样品池，以蒸馏水做空白对照，以260 nm波长处的吸光度测定其浓度，以230、260、280 nm波长处的吸光度比值确定其纯度。通过公式计算出重组质粒的拷贝数。每微升重组质粒模板中的相应基因的拷贝数（CN）： CN=[（X/（3928+b）/660）]×10-9×6.02×1023[22]，其中X为阳性质粒浓度（μg/mL）; pEASY-T1载体长3928 bp; b为masD和bamA片断长度，分别为389和354 bp; 每对碱基的平均分子量是660 Da。将已测定浓度的重组质粒进行多次10倍梯度稀释作为实时荧光定量PCR的模板。根据模板起始拷贝数的对数与循环阈值（Ct）具有反比的线性关系建立标准曲线，作为样品中masD和bamA降解基因定量的依据。

2.6 氧化石墨烯对石油烃厌氧降解影响实验

在厌氧手套箱中，将0.01 g厌氧活性污泥转移到含有100 mL灭菌无机盐培养基的120 mL无菌血清瓶中[23]。向培养体系中加入100 μL 6种正构烷烃（C15～C20）和4种苯系物（苯、甲苯、乙苯、二甲苯）等浓度混合石油烃，作为唯一碳源，添加10 mmol/L NaNO3和Na2SO4作为混合电子受体。向厌氧体系中加入不同浓度的氧化石墨烯（0.02、0.2和2 mg/L），密封，在30℃、160 r/min条件下避光培养。对照组于121℃高压灭菌20 min。分别在第2、4、6和10周进行取样，利用细菌基因组DNA提取试剂盒对样品DNA进行提取，并采用荧光定量PCR测定样品中两种厌氧降解基因的含量。

3 结果与讨论

3.1 masD和bamA基因阳性克隆的特异性扩增

为得到masD和bamA基因的陽性克隆，对厌氧活性污泥进行DNA提取，并利用设计合成的两种基因的引物对提取的DNA进行PCR扩增。将PCR扩增产物进行连接转化蓝白斑筛选阳性重组细胞，将重组细胞培养并提取重组质粒进行测序，并在NCBI数据库查询比对，结果表明，两种PCR扩增产物分别为masD和bamA基因。降解基因masD和bamA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明，经过扩增分别得到的产物都只显示一个条带，长度分别为389 bp（masD）和354 bp（bamA），与理论扩增产物片段长度一致，说明设计的引物序列、反应体系适合对降解基因masD和bamA进行特异性扩增。

3.2 实时荧光定量PCR反应体系的优化

不同引物浓度条件下masD和bamA基因实时荧光定量PCR的熔解曲线随温度变化，纵坐标为荧光强度对温度求导。当引物最终浓度为0.1和0.4 μmol/L时，两种基因在75℃时均出现非特异性扩增杂峰的干扰，出现假阳性现象。但当PCR反应体系中前后引物最终浓度均为0.2 μmol/L时，两种基因的PCR扩增均具有非常高的特异性，且未产生非特异性扩增杂峰。

当引物最终浓度为0.2 μmol/L时，不同退火温度下masD和bamA基因实时荧光定量PCR的熔解曲线。退火温度为48℃和56℃时，熔解曲线出现多条非特异性扩增杂峰及假阳性现象; 当退火温度为52℃时，熔解曲线峰型单一，显示出非常高的特异性，说明52℃为扩增masD降解基因最佳退火温度。从bamA降解基因实时荧光定量PCR的熔解曲线可见，降解基因bamA荧光定量PCR的最佳退火温度为56℃，扩增具有很高的特异性，且未产生非特异性扩增杂峰。经优化后，体系中引物最适最终浓度为0.2 μmol/L，引物masD-f、masD-r和bamA-f、bamA-r最佳退火温度分别为52℃和56℃。

3.3 标准曲线的建立

masD降解基因的荧光定量PCR检测标准曲线为Ct=5.471lgC + 42.207，相关系数R2=0.999，根据每次循环反应体系的相对荧光单位的增加量得到扩增效率E=53.0%; bamA降解基因的标准曲线为Ct=4.764lgC+40.732，R2=0.992，扩增效率E=63.6%。降解基因masD和bamA的标准曲线均具有良好的线性关系，反应体系的扩增效率均较高。

3.4 重复性检验

两种基因相同浓度的DNA模板的扩增曲线重复性良好，相同浓度的DNA模板的扩增曲线均非常接近，有的几乎重合。基于SYBR Green I荧光染料的实时荧光定量PCR已用于进行肝炎等的临床诊断[24]。本研究将其应用于masD和bamA这两种石油烃厌氧降解关键基因的定量检测，通过对设计的引物进行浓度和退火温度的优化，检测方法具有高的稳定性和重复性。

3.5 灵敏性检验

经实验，基于SYBR Green I 荧光染料的实时荧光定量PCR技术，能检测到的masD和bamA基因模板质粒最低的初始拷贝数浓度分别为6.6和5.0 copy/μL。将经过梯度稀释的这两种基因的重组质粒作为模板进行普通PCR扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。结果表明， 当两种基因模板质粒的初始拷贝数浓度分别为6.6×102和5.0×102 copy/μL时，普通PCR扩增产物在含0.5 mg/L EB的琼脂糖凝胶中的电泳结果能观察到清晰的条带。说明利用实时荧光定量PCR对两种石油烃厌氧降解基因检测的灵敏度比利用普通PCR技术高约100倍，与文献[25]灵敏度相当。这为评估厌氧环境中微生物厌氧降解石油烃的潜力提供了高效、灵敏的方法。

3.6 对厌氧培养体系中降解基因的测定

添加不同浓度氧化石墨烯的培养体系中masD的拷贝数在前6周逐渐降低，随后又略有增加。培养基中masD基因的拷贝数的最小值和最大值分别为97.2和288.7 copy/mL。氧化石墨烯的添加使masD的拷贝数在第6周显著低于对照组（p<0.05），在第10周显著高于对照组（p<0.05）。氧化石墨烯的添加量对masD的拷贝数的影响无明显规律。

随着培养时间延长，添加不同浓度氧化石墨烯的培养体系中bamA的拷贝数均逐渐减少。培养基中bamA基因的拷贝数的最小值和最大值分别为48.1和365.8 copy/mL。添加氧化石墨烯的各组bamA基因的拷贝数均显著高于空白组，其中0.02 mg/L 氧化石墨烯在第2、4周对bamA基因促进效果最明显，0.2 mg/L 氧化石墨烯在第6、10周对bamA基因促进效果最明显。说明氧化石墨烯的添加有利于促进微生物对芳香烃的厌氧降解，对烷烃的厌氧降解促进作用有限[14]。上述结果表明，两种基因的荧光定量PCR方法准确，可用于检测厌氧体系中降解基因含量。

4 结 论

烷烃和芳烃是石油烃污染物的重要组成成分，masD和bamA是这两类组分在厌氧环境中降解的关键基因。本研究设计了特异性引物，并特异性扩增出两种厌氧降解基因的DNA片段，利用SYBR Green I荧光染料结合实时荧光定量PCR技术对这两种基因进行定量检测。优化后的最佳反应条件为： 引物最终浓度0.2 μmol/L，两种基因的最适退火温度为52℃（masD）和56℃（bamA）。实验结果表明，两种基因的实时荧光定量PCR检测方法具有很高的重复性和灵敏度，灵敏度是普通PCR的100倍。本方法实现了对石油烃厌氧降解体系中降解基因的定量检测，揭示了受污染环境中厌氧微生物降解石油烃的潜力，对石油污染环境的监测和修复具有重要的借鉴意义。

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