芦根提取物与苇根提取物HPLC特征图谱的比较

谭丽容，周楚娟，程敏，黄月纯，张龙开，魏刚，王雅文

[1.无限极(中国)有限公司，广东 江门 529156； 2.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405； 3.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405； 4.广州中医药大学中药学院, 广东 广州 510006]

芦根(PhragmitisRhizoma)是禾本科植物芦苇PhragmitescommunisTrin. 的新鲜或干燥根茎，性寒味甘，具有清热泻火、生津止呕、除烦、利尿的功效，用于热病烦渴、肺热咳嗽、肺痈吐脓、胃热呕哕、热淋涩痛[1]。其酚酸类成分主要包括对香豆酸、阿魏酸等[2-3]，具有清热、止呕、抗菌消炎的作用[4-7]。芦根提取物是芦根药材采用适宜的工艺制备而成，目前已被某些保健品作为原料，如促进排铅的清基茶，辅助降血糖的绿源胶囊等[8]。苇根(ZizaniaecaducifloraeRhizoma)收载于广东省中药饮片炮制规范中，又名苇茎、野茭笋根、菰根、金苇根、菰蒋根，为禾本科植物茭笋Zizaniacaduciflora(Turcz.ex Trin.)Hand.-Mazz.的干燥根状茎，具有清热化痰、透表、除烦止渴的功效，用于久热不退、肺热咳嗽、烦渴、小儿隐疹不退、感冒发热、咳嗽。它是广东历来药用及出口的习销商品，在湖北、云南等省也有使用，分别称为金苇根、茭白根，主要用于治肺热咳嗽[9]。因名称、性状及药效上与芦根的相似性，常与芦根互相替补使用或混淆使用[10]。课题组前期研究发现，苇根药材与芦根药材具有较为类似的酚酸类成分，但药材制成提取物后，其化学成分如何，尚不明确。目前苇根提取物尚无法定标准，亦鲜有质量研究报道。因此，本研究采用HPLC特征图谱的分析技术，比较芦根提取物与苇根提取物HPLC特征图谱的差异，为芦根提取物质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

HP1200型高效液相色谱仪(包括二极管阵列检测器，美国Agilent 公司)，KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

10批芦根提取物来源于4个厂家，信息详见表1。10批苇根药材经广州中医药大学魏刚研究员鉴定为禾本科植物茭笋Zizaniacaduciflora(Turcz.ex Trin.) Hand.-Mazz.的干燥根状茎，详见表1。苇根提取物由适量药材加20倍量水煎煮3次，合并滤液，浓缩至稠膏，加适量辅料混匀，65 ℃减压干燥而得。

对香豆酸对照品(批号BCBS872，Sigma Aldrich公司，质量分数≥98.0%)；阿魏酸对照品(批号111073-201604，中国食品药品检定研究院，质量分数99.0%)；乙腈为色谱纯，德国Merck 公司；其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

表1 芦根提取物与苇根提取物样品的来源 Table 1 The sources of Phragmitis Rhizoma extract and Zizaniae caduciflorae Rhizoma extract

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相为乙腈-0.5%KH2PO4(pH=2.15)，梯度洗脱：0～15 min，7%A；15～35 min，7%A→12%A；35～55 min，12%A→15%A；55～70 min，A为15%A→19%A；70～80 min，19%A→22%A；80～85 min，22%A。进样量为15 μL；检测波长为275 nm；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min。

2.2 供试品溶液的制备

取提取物粉末0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%(体积分数，下同)甲醇50 mL，超声提取60 min，取出，放冷，滤过，蒸干。残渣加50%甲醇溶解，转移至5 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 混合对照品溶液的制备

分别取对香豆酸、阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含对香豆酸、阿魏酸分别22.2、10.6 μg的混合溶液，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取同一供试品(LG2)溶液15 μL，连续进样6次，按“2.1”项下方法测定，结果所测的特征图谱与所得的对照图谱相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取同一供试品(LG2)溶液15 μL，分别在0、3、6、9、12、24 h进样，按“2.1”项下方法测定，结果所测的特征图谱与对照图谱相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批样品(LG2)6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法进样分析，结果所测的特征图谱与所得的对照图谱相似度均大于0.99，表明方法重复性良好。

2.5 样品测定

分别取10批芦根提取物、10批苇根提取物样品，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取混合对照品、供试品溶液15 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析。

2.6 芦根提取物与苇根提取物特征图谱的比较分析

2.6.1 芦根提取物特征图谱的建立与分析 对香豆酸、阿魏酸混合对照品溶液的HPLC色谱图见图1。10批芦根提取物主要特征峰基本一致，重叠图见图2。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)”(以下简称“相似度软件”)生成的对照图谱，共标示出7个特征峰，见图5。芦根提取物1(LG1)的7个特征峰的紫外光谱图见图3。以峰6(对香豆酸)作为参照峰，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表2。

t/min72.2030.22-11.76mAU0.0012.3224.6436.9649.2861.6073.9286.2412

1.对香豆酸； 2.阿魏酸。

图1对香豆酸、阿魏酸混合对照品溶液的HPLC色谱图

Figure1HPLC chromatogram of the mixed referencesp-coumaric acid and ferulic acid

436.40327.20218.00108.80-0.40mAU12.3224.6436.9649.2861.6073.9286.240.00t/minS10S9S8S7S6S5S4S3S2S1

S1～S10.表1中LG1～LG10。

图210批芦根提取物的HPLC特征图谱

Figure2HPLC characteristic spectra of the 10 batchesPhragmitisRhizomaextract

2.6.2 苇根提取物特征图谱的建立与分析 10批苇根提取物样品能检出与芦根提取物一致的7个特征峰，但比芦根提取物多6个黄酮紫外光谱特征的特征峰(峰w1～w6)。不同批次主要特征峰基本一致，重叠图见图4。将10批样品特征图谱用相似度软件生成对照图谱，见图5。苇根提取物样品WG1的6个黄酮特征峰的紫外光谱图见图6。以峰6(对香豆酸)作为参照峰，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表3。

12.5107.552.50mAU12.5107.552.506420mAU806040200864203020100121086420250300350400250300350400250300350400250300350400250300350400250300350400250300350400峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm

图3芦根提取物(LG1)特征峰的紫外光谱图

Figure3Ultraviolet spectra of characteristic peaks ofPhragmitisRhizomaextract(LG1)

表2 10批芦根提取物HPLC特征峰的平均相对保留时间及相对峰面积Table 2 Relative retention time and relative peak area of HPLC characteristic peaks of Phragmitis Rhizoma extract

186.79124.4362.07-0.29mAU12.3224.6436.9649.2861.6073.9286.240.00t/minS10S9S8S7S6S5S4S3S2S1

S1～S10. 表1中WG1～WG10。

图410批苇根提取物的HPLC特征图谱

Figure4HPLC characteristic spectra of the 10 batchesZizaniaecaducifloraeRhizomaextract

2.6.3 芦根提取物与苇根提取物特征图谱的比较分析 分别将10批芦根提取物、10批苇根提取物的HPLC图谱以AIA格式依次导入相似度软件，对照图谱的生成方法为均值数法，时间窗宽度设为0.1，运用多点校正方法对各色谱峰进行全峰匹配，生成特征图谱对照模式。10批芦根提取物、10批苇根提取物的HPLC图谱分别以生成的芦根提取物、苇根提取物对照图谱(分别为S1、S2)为对照，进行相似度计算，相似度结果见表4。

12.3224.6436.9649.2861.6073.9286.240.00t/min130.6487.0543.47-0.12mAU123456(S)71234567S1w1w2w3w4w5w6S2

6.对香豆酸； 7.阿魏酸。

图5芦根提取物(S1)、苇根提取物(S2)的对照图谱

Figure5HPLC characteristic spectra ofPhragmitisRhizomaextract (S1)andZizaniaecaducifloraeRhizomaextract(S2)

806040200250300350400峰w1λ/nm403020100250300350400峰w4403020100250300350400峰w2121086420250300350400峰w314121086420250300350400峰w6λ/nm20151050250300350400峰w5λ/nmmAUmAU

图6苇根提取物(WG1)6个特征峰(w1～w6)的紫外光谱图

Figure6Ultraviolet spectra of HPLC characteristic peaks (w1-w6)ofZizaniaecaducifloraeRhizomaextract(WG1)

表3 10批苇根提取物HPLC特征峰的平均相对保留时间及相对峰面积Table 3 Relative retention time and relative peak area of HPLC characteristic peaks of Zizaniae caduciflorae Rhizoma extract

表4 10批芦根提取物、10批苇根提取物HPLC特征图谱的相似度结果

Table4The similarities of HPLC characteristic spectra ofPhragmitisRhizomaextract andZizaniaecaducifloraeRhizomaextract

批号相似度批号相似度LG10.980WG10.857LG20.974WG20.941LG30.977WG30.907LG40.999WG40.807LG50.992WG50.973LG60.989WG60.944LG70.979WG70.967LG80.999WG80.924LG90.996WG90.963LG100.935WG100.964

在275 nm检测波长下，芦根提取物以S1为对照，相似度在0.935～0.999之间，而苇根提取物除2批相似度较低外，其他8批相似度均高于0.9，提示芦根与苇根提取物有一定的特征峰稳定性，所建立的特征图谱可各自作为质控参考。2种提取物对照图谱的相似度为0.973，相似度较高是因为保留时间在0～49.28 min间，二者特征峰大多类似；但在保留时间49.28～86.24 min，苇根提取物可检出6个黄酮特征峰(w1～w6)。2种药材提取物特征图谱有明显差异，可以达到鉴别目的。

3 讨论

文献报道，芦根HPLC指纹图谱的检测波长主要有236、250 nm[11-12]。经预实验发现，苇根提取物含有几个具有黄酮光谱特征的特征峰，在330～350 nm附近有最大吸收，因此，通过对250、275、310、340 nm 4个波长下特征峰及峰面积比较发现，在310 nm处对对香豆酸、阿魏酸等酚酸类成分的吸收较大，但275 nm时能检出更多特征峰，对苇根的黄酮类特征峰亦有相对较大吸收，因此选择275 nm为特征图谱的检测波长。比较了乙腈-不同酸水(0.3%乙酸、0.1%H3PO4、0.2%甲酸)、甲醇-不同酸水(0.3%乙酸、0.1%H3PO4、0.2%甲酸)、乙腈-0.5%KH2PO4(pH=2.15)系统的分离效果，结果乙腈-0.5%KH2PO4(pH=2.15)系统下芦根提取物与苇根提取物特征峰能够得到较好分离，特别是苇根提取物的黄酮特征峰分离度良好。

10批芦根提取物均能检出7个特征峰，样品相似度在0.935以上，提示不同来源芦根提取物质量较稳定。10批苇根提取物亦均检出与芦根一致的7个特征峰(峰1～7)，但比芦根提取物多6个黄酮类特征峰(峰w1～w6)，有明显差别。因此，本研究建立的方法能达到鉴别芦根提取物与苇根提取物的目的。