响应面法优化芦柑皮中柠檬苦素类化合物的提取工艺

汤海霞，董雅娴，贲永光

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

芦柑又名真柑、乳柑、柑果，是柑橘中最常见的品种之一，在我国南方广泛种植，其味道芳香甘美，风味独特，具有生津止渴、和胃利尿等功效，在国内外农产品贸易中占有非常重要的地位[1]。随着芦柑产量的逐年增加，芦柑果皮的综合利用就越发显得重要。但是，国内大部分芦柑皮渣未得到充分利用，传统做法是加工成动物饲料、肥料或废弃物处理，经济效益低，且易污染环境[2-4]。目前，国内对于资源节约和环境保护的重视，使得皮渣的综合利用日益被关注。

芦柑果皮中含有香精油、果胶、桔皮色素、柑橘纤维、黄酮类化合物和类柠檬苦素等功能性成分，这些成分在食品、医药等方面具有广泛的用途。柠檬苦素类化合物也是芦柑果皮中一种主要生理活性成分，是一类高度氧化的含呋喃环三萜类化合物，具有诸多生物学功能，如抗氧化性、抑菌性和抗肿瘤性等[5-7]。柠檬苦素类化合物在加工处理过程中容易发生结构的变化，甚至会使其失去活性。因此，在提取、分离、纯化柠檬苦素类化合物的过程中必须严格控制温度、pH值等因素[8]。

目前，柠檬苦素类化合物的主要提取方法有有机溶剂法、系统溶剂提取法、超声波提取法、超临界萃取法等[9-11]。相比传统的提取方法，超声提取具有提取时间短、节约溶剂、提取率高、应用广泛等优势和特点[12]。本文旨在探讨超声辅助提取芦柑皮中柠檬苦素类化合物的工艺，并采用响应面法优化工艺条件，以期为柑橘果皮的综合利用提供理论依据与工艺参考。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

DFY-600摇摆式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器)；KQ-400DB型台式数控超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)；752N紫外/可见分光光度仪(上海仪电分析仪器设备有限公司)。

1.2 原料与试剂

芦柑(产地：福建漳州)，经广东药科大学中药学院滕希峰讲师鉴定为芸香科柑橘属(Citrus reticulata Blanco)芦柑品种；柠檬苦素对照品(质量分数≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；石油醚、无水乙醇(分析纯，天津致远化学试剂有限公司)；对二甲氨基苯甲醛、三氯化铁、二氯甲烷(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；H2SO4(分析纯，广州化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 样品前处理

取芦柑手工去皮，将果皮用自来水清洗干净后，再用去离子水冲洗干净，置于烘箱内(40～50 ℃，48 h)烘至水分的质量分数为5%左右，经粉碎机粉碎后，过40目筛。称量过筛后的芦柑皮粉末的重量，放入锥形瓶中并加入石油醚(1 g芦柑皮粉末加入100 mL石油醚)，密封，放置恒温箱中，37 ℃浸泡脱脂10 h，抽滤除去石油醚后，放置烘箱中60 ℃干燥，干燥后放于密封袋中，备用。

2.2 柠檬苦素类化合物的测定方法

2.2.1 显色剂的配置 显色剂A液：将125 mg对二甲氨基苯甲醛溶于100 mL的H2SO4和乙醇混合液中(H2SO465 mL，无水乙醇35 mL)，放冷备用。显色剂B液：称取FeCl39.0 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL；使用时，现配现用，将B溶液0.5 mL加入到A溶液，摇匀即可[1]。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取柠檬苦素对照品15.0 mg，溶于无水乙醇中后转移至50 mL容量瓶，定容，得300 μg/mL的对照品溶液，待用。取1 mL，加入无水乙醇2 mL，再加5 mL显色液，摇匀，静置30 min后进行光谱扫描，于500 nm波长下检测吸光度。

精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL对照品溶液于7个试管中，并以无水乙醇稀释至3 mL，再分别加入5 mL显色液，以柠檬苦素空白液为参比，显色30 min后在500 nm处测定其吸光度。得到标准曲线方程：y=0.002 5x+0.002 5，R=0.999 1。

2.2.3 样品的处理与测定 精密称取1.5 g脱脂且干燥的芦柑果皮粉于试管中，按一定料液比，加入一定浓度的提取溶剂，在一定超声功率下超声一定时间后，抽滤得到提取液，提取液经减压浓缩，浓缩液溶于二氯甲烷并过滤，滤液经减压浓缩后用无水乙醇复溶，转移至25 mL容量瓶，定容。精密吸取溶液3 mL，加入5 mL显色剂，摇匀，静置显色30 min后于500 nm处测定吸光度。按下列公式计算柠檬苦素类化合物的提取率(Y)：

式中：C为标准曲线对应的柠檬苦素类化合物质量浓度，μg/mL；D为稀释倍数；V为提取液体积，mL；W为原料质量，g。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取时间的选择 精密称取1.5 g脱脂且干燥的芦柑果皮粉5份于试管中，固定液料比为15∶1(mL∶g)，乙醇体积分数为70%，超声功率为400 W，考察超声时间分别为12、14、16、18、20 min对柠檬苦素类化合物提取率的影响，结果见图1(A)。可见,提取时间为14 min时，柠檬苦素类化合物的提取率最佳。

2.3.2 液料比的选择 精密称取1.5 g脱脂且干燥的芦柑果皮粉5份于试管中，固定提取时间为14 min，乙醇体积分数为70%，超声功率为400 W，考察液料比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1(mL∶g)对柠檬苦素类化合物提取率的影响，结果见图1(B)。可见，当物料比为15∶1 mL/g时，柠檬苦素类化合物的提取率最佳。

2.3.3 超声功率的选择 精密称取1.5 g脱脂且干燥的芦柑果皮粉5份于试管中，固定提取时间为14 min，液料比为15∶1，乙醇体积分数为70%，考察超声功率为240、280、320、360、400 W对柠檬苦素类化合物提取率的影响，结果见图1(C)。可见，当超声功率为360 W时，柠檬苦素类化合物的提取率最佳。

2.3.4 提取溶剂体积分数的选择 精密称取1.5 g脱脂且干燥的芦柑果皮粉5份于试管中，固定提取时间为14 min，液料比为15∶1，超声功率为360 W，考察乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%时对柠檬苦素类化合物提取率的影响，结果见图1(D)。可见，当乙醇体积分数为80%左右时，柠檬苦素类化合物的提取率最佳。

提取率//(mg?g-1)765432107654321076543210876543210101214161820222002402803203604004401015202530055060708090提取时间/min液料比/(mL∶g-1)超声功率/W乙醇体积分数/%ABCD

图1提取时间(A)、料液比(B)、超声功率(C)和乙醇体积分数(D)对柠檬苦素类化合物提取率的影响

Figure1Effect of time (A),solid-to-solvent ratio (B),ultrasonic power (C),ethanol concentration (D) on the extraction yield of limonoids

2.4 响应面法优化柠檬苦素类化合物的提取工艺

2.4.1 因素与水平的选取 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用4因素3水平响应面分析方法，在单因素试验的基础上，以1、0、-1分别代表自变量的高中低水平，试验因素与水平见表1。

表1 因素与水平设计表Table 1 The factors and levels for RSA

注：X1=(X1-80)/10；X2=(X2-360)/40；X3=(X3-15)/5；X4=(X4-14)/2。

2.4.2 回归方程的建立 在4因子Box-Benhnken试验设计中试验号1-24是析因试验点，试验号25-29是零点试验，其中析因点为自变量X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点区域为中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。以X1、X2、X3、X4为自变量，以原料中柠檬苦素类化合物提取率为响应值(Y)，试验设计和结果见表2。将结果利用软件DesignExpert8.0分析处理，得到以柠檬苦素提取率(Y)为响应值的二次回归方程：

Y=8.11-0.042X1+0.064X2-0.017X3+0.032X4-0.024X1X2-6.711-3X1X3-0.023X1X4-0.097X2X3-0.056X2X4+0.11X3X4-1.03X12-0.22X22-0.36X32-0.20X42。

2.4.3 回归模型分析 用软件DesignExpert8.0对回归模型进行方差分析，以柠檬苦素类化合物提取率为响应值的回归模型方差分析见表3。

由表3可知，失拟项F值=3.05，检验不显著，说明失拟平方和较小，基本是由试验误差等偶然因素引起的，拟合良好。回归项F值=16.24，检验极显著(P<0.01)，且回归方程决定系数R2为0.942 0，修正决定系数AdjR2为0.884 0，说明该模型与实际拟合良好，可用于芦柑果皮中提取柠檬苦素类化合物的分析和预测。

2.4.4 各因素交互作用分析 为进一步直观说明乙醇体积分数(X4)、提取时间(X1)、超声功率(X3)和液料比(X2)之间的相互作用对柠檬苦素类化合物提取率的影响，根据试验结果做出相应的响应面3D图和等高图，见图2。可见，各因素之间两两交互作用对柠檬苦素类化合物提取率的影响均均无统计学意义。

2.4.5 最佳工艺与验证试验 由软件DesignExpert8.0预测出柠檬苦素类化合物提取条件优化结果为：提取时间14.29min，液料比15.25∶1 (mL∶g)，超声功率358.61W，乙醇体积分数80%，柠檬苦素类化合物提取率预测可达8.12mg/g。为实际操作方便，将上述最优提取条件简化为：提取时间14min，液料比15∶1 (mL/g)，超声功率360W，乙醇体积分数80%。进行3次重复试验，结果测得提取率分别为8.07、8.10、8.03mg/g，平均提取率为8.07mg/g，RSD=0.01%，与理论预测值相差很小，且RSD值较小，精密度较好，说明采用响应面优化得到的提取条件可靠。

表2 Box-Benhnken响应面试验设计和结果Table 2 Design and experimental results of Box-Benhnken response surface method

表3 方差分析结果Table 3 The analysis of variance

注：*P<0.05为差异有统计学意义；R2=0.942 0，AdjR2=0.884 0。

X2:液料比/(mL∶g)X4:乙醇体积分数/%X1:提取时间/minX3:超声功率/WX4:乙醇体积分数/%X4:乙醇体积分数/%X3:超声功率/WX1:提取时间/minX1:提取时间/minX3:超声功率/WX2:液料比/(mL∶g)X2:液料比/(mL∶g)BACDEF

图2各因素交互作用的响应面图

Figure2ResponsiveSurfaceandcontoursoftheinteractionofeachfactors

3 讨论

本文对芦柑皮中柠檬苦素类化合物的超声提取工艺进行了研究，考察了超声功率、提取时间、液料比、提取溶剂浓度等因素对柠檬苦素类化合物提取率的影响，采用响应面分析法优选最佳提取工艺条件，在此最优工艺条件下，芦柑皮中柠檬苦素类化合物的提取率为8.07 mg/g，与文献报道的用酸碱水提取芦柑皮中柠檬苦素的结果(0.133 mg/g和0.117 mg/g)[14-15]比较，本文的提取率明显提高，且减少了酸碱和有机溶剂等的使用，污染环境可能性小，体现了超声技术操作简单、高效和节能等优点。