丹参与其伪品、混淆品比较鉴别分析

朱海龙，覃婕媛，陈晓丹，林伟斌，张龙开，姚松君，魏刚

[1.无限极(中国)有限公司，广东 广州 510000； 2.弘正道(中国)中药研究有限公司，广东 广州 510000； 3.天方健(中国)药业有限公司，广东 广州 510000； 4.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006]

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，具有活血化瘀、通经止疼、清新除烦、凉血消痈的功效[1]。丹参是临床上作为治疗心血管疾病、消化系统疾病、缺血性脑卒中、肝硬化、恶性肿瘤等病症的重要原料药[2]，主要道地产区为安徽、湖北、四川、河南、山西和山东等地[3]。丹参的活性成分主要为两大类，一类为脂溶性丹参酮类成分，如隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA等；另一类为水溶性酚酸成分，如丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 等，这些活性成分对丹参药理作用及临床应用发挥着重要的作用[4]。近年来，丹参因其药用价值较高，市场需求量较大，其伪品和混淆品也逐渐增多，给丹参药材的质量、临床用药的安全性和有效性带来较大的影响。

目前，市场上丹参的主要伪品为牛蒡根和川续断，主要的混淆品或地方习用品为甘肃丹参、滇丹参和白花丹参，虽然已有相关文献报道过丹参及其伪品或混淆品的性状及相关理化鉴别[5-12]，但大多数文献对于丹参及其伪品或混淆品的性状、显微特征及TLC研究比较仅仅限于文字描述，尤其是HPLC图谱和含量测定比较研究更未见报道。因此，本研究通过性状鉴别、显微鉴别、薄层以及高效液相色谱法对丹参及其伪品、混淆品进行详细的研究，有助于对丹参的准确鉴定分析，以保证临床用药的疗效及安全性。

1 材料与仪器

1.1 仪器

高效液相色谱仪(日本岛津公司，DAD检测器)；AB204-N精密天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-400KDE高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；OLYMPUS SZ61体视显微镜(日本Olympus公司)；HWS24电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；薄层色谱硅胶G预制板(青岛海洋化工有限公司)。

1.2 材料与试剂

丹参对照药材(批号：120923-201615)、丹参酮ⅡA(批号：110867-201607)、隐丹参酮(批号：110852-201807)、丹酚酸B(批号：111562-201716)均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈(色谱级，德国Merck)；其他试剂为分析纯。

丹参、牛蒡根、川续断、甘肃丹参、滇丹参及白花丹参样品均为上海健康医学院生药学家顺庆生教授与无限极(中国)有限公司收集，并由顺庆生教授鉴定，具体来源见表1。

2 方法与结果

2.1 丹参及其伪品、混淆品的性状鉴别

从图1可见，丹参根呈长圆柱形，表面棕红色或暗棕红色、粗糙，具纵皱纹，外皮有的呈鳞片状脱落，断面皮部棕红色，木部灰黄色或紫褐色，导管束黄白色，呈放射状排列；牛蒡根茎稍膨大，残留的茎基有长绵毛，根长圆柱形，较顺直，表面棕褐色或黑褐色，皮部黑褐色，木部黄白色，形成层明显；川续断圆柱形，略扁，弯曲，表面棕褐色或灰褐色，有多数明显而扭曲的纵纹及沟纹，具横长皮孔及须根痕，皮部绿褐色或淡褐色，木部黄褐色，形成层明显；甘肃丹参体型明显大于丹参，圆锥形，扭曲麻花状或辫子状，多分枝，质地较松，断面极不整齐，具有明显纤维性；滇丹参则弯曲纺锤形，芦头具有数个密集的叶痕，成节，常拐角，断面不整齐，浅棕黄色，外层有时暗棕色，边缘红紫色；白花丹参为丹参的一个变型，故外观与丹参极为相似，不同点在于白花丹参根的断面皮部灰白色，木部黄白色。综上所述，可通过性状差异，初步区分丹参及其伪品、混淆品。

2.2 丹参及其伪品、混淆品粉末的显微鉴别

从图2可见，丹参的石细胞类圆形、类三角形、类长方形或不规则形，且有的含黄棕色物，木纤维多为纤维管胞，长梭形，导管网纹导管和具缘纹孔导管，木栓细胞黄棕色，表面类方形或多角形，壁稍厚，不含晶体；牛蒡根的木纤维多细长，沟孔不明显，含有菊糖呈扇形，有放射纹理；川续断可见有斜向交错的纹理纺锤形薄壁细胞，草酸钙簇晶众多，多见成行排列；滇丹参、甘肃丹参及白花丹参的木纤维、导管和木栓细胞显微特征与丹参差别较小，滇丹参和甘肃丹参中可观察到孔沟明显、含黄棕色物的石细胞，但是白花丹参中未见石细胞。综上所述，丹参与牛蒡根、川续断、白花丹参可通过显微粉末鉴别区分，较难鉴别甘肃丹参和滇丹参。

2.3 丹参及其伪品、混淆品的薄层色谱鉴别

参照2015年版《中国药典》丹参项下条件，照薄层色谱法(通则0502)试验[1]，在日光和紫外灯(365 nm)下检视可知，丹参对照药材与牛蒡根、川续断供试品的薄层斑点位置和颜色明显不一致，牛蒡根和川续断不含丹参酮ⅡA紫色斑点，但是紫外灯下清晰可见牛蒡根、川续断有与对照品丹酚酸B斑点位置相近的斑点；甘肃丹参与对照品、对照药材色谱对比可知，含有丹参酮ⅡA斑点，但不含丹酚酸B斑点，并在其丹参酮ⅡA斑点下有较亮的荧光斑点可以明显与丹参区别；滇丹参与对照品、对照药材对比可知，其丹酚酸B、丹参酮ⅡA斑点以及其他斑点均较黯淡，但丹参酮ⅡA斑点下有较暗的荧光斑点；白花丹参供试品色谱中，在与对照品、对照药材及丹参色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点和荧光斑点。综合以上结果，根据2015年版《中国药典》薄层色谱条件，可以明显区别丹参的伪品牛蒡根和川续断，以及其混淆品甘肃丹参和滇丹参，但是难以区别白花丹参，结果见图3。

表1 丹参及其伪品、混淆品样品来源Table 1 The sources of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its counterfeit,adulterants

A.丹参(1.纵皱纹; 2.外表红色或暗棕红色; 3.外皮有的呈鳞片状脱落)； B.牛蒡根(1.纵沟纹; 2.茎基处长棉毛; 3.外表皮棕褐色或黑褐色)； C.川续断(1.扭曲纵沟纹纹; 2.稍扁; 3.质稍软； 4.外表皮棕褐色或灰褐色)； D.甘肃丹参(1.分枝多扭曲; 2.体形较大，质松而脆)； E.滇丹参(1.叶痕密集成节; 2.纺锤形； 3.数个簇生)； F.白花丹参(1.须根众多; 2.外表皮棕红色或暗棕红色)。

图1丹参及其伪品、混淆品的性状

Figure1The trait characteristics of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its counterfeit,adulterants

A.丹参(1a、1b.石细胞; 2.木栓细胞; 3a、3b.木纤维; 4a、4b.导管)； B.牛蒡根(1a、1b.菊糖; 2.木栓细胞; 3a、3b.木纤维; 4a、4b.导管)； C.川续断(1a、1b.簇晶; 2.木栓细胞; 3a、3b.薄壁细胞; 4a、4b.导管)； D.白花丹参(1.木栓细胞; 2a、2b.木纤维; 3a、3b.导管)； E.滇丹参(1a、1b.石细胞; 2.木栓细胞; 3a、3b.木纤维; 4a、4b.导管)； F.甘肃丹参(1a、1b.石细胞; 2.木栓细胞; 3a、3b.木纤维; 4a、4b.导管)。

图2丹参及其伪品、混淆品的显微特征

Figure2The microscopic characteristics of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its counterfeit,adulterants

2.4 丹参及其混淆品的HPLC特征图谱鉴别

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Zorbax SB-Aq(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)-质量分数0.1%H3PO4溶液(B)作为流动相，梯度洗脱(0～20 min，15%～25%A；20～35 min，25%～60%A；35～45 min，60%～70%A；45～70 min，70%～80%A)；流速:1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：270 nm；进样量：5 μL。

1.牛蒡根； 2.川续断； 3.甘肃丹参； 4. 滇丹参； 5.白花丹参； 6.丹酚酸B和丹参酮ⅡA； 7.丹参对照药材； 8.丹参。

图3丹参药材及其伪品、混淆品薄层色谱图

Figure3TLC of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its counterfeit,adulterants

2.4.2 供试品溶液的制备 丹参及其混淆品(甘肃丹参、滇丹参及白花丹参)样品切断约1 cm，60 ℃烘箱烘干，粉碎，过4号筛，取样品粉末1 g，精密称定，置于25 mL锥形瓶中，加入乙醇10 mL，超声提取15 min，放至室温，离心，取上清液，0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.4.3 对照品溶液的制备 取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇-水(体积比8∶2)混合溶液，制成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得；取丹参酮ⅡA和隐丹参酮对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.4.4 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液5 μL，连续进样6次，考察色谱图的相似度，相似度均大于 0.99，各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液5 μL，分别在0、2、6、12、18、24 h进样分析，相似度均大于 0.99，各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值均小于3.0%，表明24 h内供试品溶液稳定；

2.4.6 重复性试验 取同一批丹参样品，制成6份供试品溶液并进样分析，相似度均大于 0.99，各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值均小于3.0%，表明方法重复性良好。

2.4.7 丹参及其混淆品特征图谱分析 分别取表1中11批丹参样品，按“2.4.1”项下色谱条件测定，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，以均值数法分析，生成丹参对照图谱，共标示出9个特征峰，通过对照品保留时间定位，鉴定峰3、7、9分别为丹酚酸B、隐丹参酮及丹参酮ⅡA。将丹参对照HPLC图谱及其混淆品HPLC图谱对比可知，滇丹参的峰面积均较低，其丹参酮类成分比例与丹参有一定的区别，没有丹参1、2号特征峰，且丹酚酸B的相对含量偏低；而甘肃丹参几乎不含有丹酚酸B，没有丹参2号特征峰；白花丹参与丹参二者特征图谱相似度较高，此色谱条件未能有效区分白花丹参与丹参，特征图谱分析结果与薄层色谱鉴别结果相一致，结果见图4。

2.5 丹参及其混淆品的质量分数测定

参照2015年版《中国药典》丹参项下条件，按高效液相色谱法(通则0512)测定所收集的丹参及其混淆品的质量分数[1]，《中国药典》要求含丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的总量不得少于0.25%，含丹酚酸B不得少于3.0%。本研究的测定结果表明，收集所得丹参和白花丹参所含丹酚酸B的质量分数均符合《中国药典》要求，滇丹参中丹酚酸B质量分数低于《中国药典》要求，而甘肃丹参中的质量分数极少；丹参、白花丹参、甘肃丹参所含的丹参酮类总量符合《中国药典》要求，滇丹参和所购的丹参饮片丹参酮类总量低于《中国药典》要求；质量分数测定结果与薄层色谱鉴定结果、HPLC特征图谱结果相一致，表明丹参与滇丹参中丹酚酸B的质量分数和丹参酮类总量有明显区别，而与甘肃丹参中丹酚酸B质量分数有明显区别，但是无法区别白花丹参，结果见表2。

白花丹参甘肃丹参滇丹参丹参2000150010005000U/mV010203040506070t/minS1S2S3S4

3.丹酚酸B；7.隐丹参酮；9.丹参酮ⅡA。

图4丹参及其混淆品HPLC特征图谱

Figure4HPLC characteristic spectrums of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its adulterants

表2 丹参及其混淆品中丹酚酸B与丹参酮类的质量分数测定结果Table 2 The content of tanshinones in the Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its adulterants

3 讨论

丹参是中医药领域中临床应用较为广泛、疗效确切的中药材，植物资源丰富，全国大部分地区均有栽培，但随着丹参的广泛应用，其伪品及混淆品也逐渐增多，本研究对丹参及其伪品(牛蒡根、川续断)、混淆品(甘肃丹参、滇丹参及白花丹参)进行了系统的鉴别研究，填补了目前所缺失的性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱(TLC)鉴别比较的报道，以及高效液相色谱(HPLC)鉴定和含量测定的比较研究。

综合本研究结果可见：(1)从性状鉴别来看，丹参及其伪品、混淆品外观性状特征具有一定差别，从外观形状和颜色能较好区分牛蒡根、川续断、甘肃丹参、滇丹参，对于外观较为相似的白花丹参，可从白花丹参断面皮部灰白色与丹参皮部棕红色进行初步区别，但是近几年也逐渐出现了皮部呈灰白色的丹参，与药典描述并不相符，应该注意这种变化，可进一步根据显微观察粉末中是否含有石细胞进行鉴别。(2)从显微鉴别来看，丹参能与其伪品牛蒡根、川续断区分，三者显微特征差别较为明显，伪品牛蒡属菊科，川续断属于川续断科，牛蒡根含有菊糖，川续断草酸钙簇晶众多，并成行排列，丹参不含有菊糖和晶体，可作为三者主要鉴别特征；而丹参混淆品白花丹参、甘肃丹参和滇丹参均为丹参同科植物，显微特征差异小，较难区分，其中丹参和甘肃丹参、滇丹参均可观察到石细胞，但是白花丹参却未观察到石细胞，目前相关文献也未见报道过白花丹参粉末观察到石细胞[13-14]，可作为其鉴别特征之一。(3)从TLC鉴别来看，采用2015年版《中国药典》中丹参项下TLC方法，根据两个伪品的薄层色谱斑点位置、颜色与对照药材色谱对比，可以明显区别牛蒡根和川续断，甘肃丹参薄层色谱中不显示丹酚酸B斑点，并在紫外灯(365 nm)下可根据甘肃丹参与滇丹参丹参酮ⅡA斑点下的荧光斑点可与丹参对照药材区分，但是无法区别白花丹参。(4)从HPLC特征图谱鉴别来看，根据丹酚酸B、丹参1号、2号特征峰、及丹参酮类成分比例可以区分丹参与甘肃丹参、滇丹参，但是难以区别白花丹参；(5)从含量测定来看，甘肃丹参中丹酚酸B含量极少，而滇丹参中丹酚酸B和丹参酮类总量远远低于正品丹参及者《中国药典》规定的要求，这也是丹参与其混淆品不能混用的重要原因之一，白花丹参中丹参酮类总量及丹酚酸B的含量符合《中国药典》要求。综上所述，本研究所提出的性状、显微、TLC法、HPLC法鉴别可以简便、快速、高效、准确地鉴别丹参及其伪品、混淆品药材，为丹参药材的质量保障提供参考依据。