溶瘤单纯疱疹病毒抗肿瘤作用及其机理研究

刘 硕，钱云云，张荣波，吴 静，胡 东

(安徽理工大学医学院医，安徽 淮南 232001)

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是目前在临床使用最广泛的溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)。HSV以溶瘤剂的角色应用于临床的优点包括：HSV可感染大多数肿瘤细胞；HSV病毒粒子具有对肿瘤细胞产生病毒毒素的能力；具有庞大的基因组，易于基因改造，插入多个治疗靶基因；是人类普遍携带的病原体,易引起自身限制性免疫，并且已有治疗HSV的相关抗病毒药物。溶瘤HSV(oncolytic HSV，oHSV)病毒用于肿瘤治疗的首要问题是面对宿主免疫、复杂的肿瘤微环境以及肿瘤细胞异质性等，如何通过基因工程的方法将某些外来基因插入到oHSV中，或联合其他传统疗法，提高OV治疗的安全性及靶向肿瘤细胞的特异性是目前研究的重点。2015年，经美国食品和药物管理局(FDA)批准，用于治疗黑色素瘤的talimogene laherparepvec(T-VEC)是对HSV-1基因改造后形成的有效临床治疗药物，也是OV应用于临床的重大突破[1- 2]。大部分oHSV仍处于I期和II期临床试验，各类临床数据显示出其良好的安全性，然而临床试验显示其长期使用效果不明显，缺乏有效的III期临床试验数据。

1 HSV的生物学特点

HSV为双链DNA病毒，可编码84种不同多肽，其基因组长为 152Kb。HSV 基因组由两个独特的序列组成：长节段(Unique Long (uL)) 和 短节段(Unique Short (uS))，两端为末端反向重复序列，以内部反向重复序列连接。HSV溶瘤性质是由lystic基因决定。病毒基因按照其表达的时序性分为三个类别：早期或α基因、中期或β基因、晚期或γ基因。这些lystic基因编码蛋白可促进病毒的复制并引发宿主免疫反应[3]。lystic复制周期包括α基因增强β基因转录和合成蛋白质的过程，这是DNA复制必不可少的步骤。α基因的主要功能是调节β和γ基因的转录。DNA复制后，γ基因编码病毒粒子结构成分。病毒DNA复制和蛋白质合成导致癌细胞裂解，随后，后代病毒被释放以感染相邻的癌细胞，扩大对癌症的杀伤能力。HSV可以通过局部(腹膜或胸膜灌注和肿瘤内注射)和全身途径(血管传递)发挥作用。肿瘤内注射可限制其只传送到肿瘤部位。一些物理障碍如细胞外基质和针对HSV的宿主免疫应答反应会抑制病毒复制。

目前，HSV的基因修饰大部分都基于ICP6基因(uL39)失活和γ134.5基因缺失[4]。ICP6蛋白是对病毒DNA复制而言必不可少的核糖核苷酸还原酶的大亚基。ICP6突变的HSV只能在快速分裂的细胞如肿瘤细胞中复制，不能在静止的细胞中复制，可提高其肿瘤靶向性。病毒基因γ134.5是HSV中的主要神经毒性基因[5]。真核细胞翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α，eIF-2α)的α亚基磷酸化会阻断宿主蛋白质合成，而γ134.5编码蛋白质ICP34.5的表达导致eIF-2α脱磷酸化，解除其对蛋白质合成的抑制作用。RAS/丝裂原活化蛋白激酶途径通常在癌细胞中被激活，这使得γ134.5缺陷型的HSV可选择性地在癌细胞中复制。作为遗传修饰的结果，ICP6/γ134.5缺失的HSV对正常组织具有低致病性，对肿瘤细胞具有高的溶瘤能力[6]。有研究构建了三个单/双荧光标记和γ134.5缺失的重组HSV-1载体用于快速分离和选择不同HSV的载体，生产了三种重组病毒，HSV-GFP，HSV-GR和HSV-Red。HSV-GFP比其他类型显示出较高的滴度，细胞毒性分析显示HSV-GR比HSV-Red可以裂解更多靶肿瘤细胞。与HSV-GR(82%)相比，HSV-GFP显示较高的感染效力(98%)。 这些载体也可用于追踪治疗剂对靶细胞的功效、 体外或体内神经或肿瘤细胞的成像以及作为癌症治疗的OV。

2 oHSV的临床应用

HSV-1和HSV-2感染非分裂细胞如神经元，表达用于各种核苷酸代谢和DNA合成的病毒同系物。DLSPTK是第一个设计的HSV-1衍生物，由于缺失编码胸苷激酶(thymidine kinase，TK)病毒同系物-uL23基因，只能在过表达TK的癌细胞中复制[7]。DLSPTK在治疗恶性人神经胶质瘤显示出有效的抗肿瘤特性和减弱的神经毒力。然而，TK缺失也会导致DLSPTK对核苷类似物类抗病毒药物(如阿昔洛韦)的抗性，高剂量颅内接种DLSPTK会导致致命性脑炎[8]。

R3616是HSV-1(F)衍生重组病毒，缺失两个拷贝的γ134.5基因[5]。宿主蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)感应各种应激源如病毒dsRNA，阻止病毒蛋白质的合成。ICP34.5的功能之一是介导eIF2a的去磷酸化，解除蛋白合成抑制。因此，R3616靶向以不可控蛋白质合成为特征的癌细胞。与传统疗法相比，R3616可以引起更有效的宿主抗肿瘤免疫反应。在小鼠结肠癌模型中，R3616可诱导大量的浸润性T细胞，巨噬细胞和树突状细胞[9]。R3616与吉西他滨联合治疗晚期胰腺癌可产生协同作用[10]。最近，文献[11]等报道了通过将病毒吸附到肿瘤抗原特异性淋巴细胞上来以提高R3616靶向性。R3616不仅可以治疗原发性肿瘤病变，还可以对多种复发转移性肿瘤产生溶瘤效应。R1716突变体也是ICP34.5缺失型HSV。

DM33是γ134.5和LAT基因双缺失的重组HSV-1OV。与DLSPTK不同，DM33的突变基于McKrae毒株，具有更强的增殖能力并诱导更强烈的抗肿瘤效应。在颅内携带U-87 MG人神经胶质瘤的裸鼠模型中，小鼠接受DM33治疗后其生存时间延长，组织学分析显示DM33治疗组加速了肿瘤细胞溶解。在另一项研究表明，在胶质瘤中DM33显示剂量依赖的抗肿瘤活性。DM33的安全性在于其对神经元细胞，星形胶质细胞和内皮细胞的减毒作用。基于其功效和安全性，DM33显示其巨大的溶瘤治疗潜在价值。

NV1020是衍生自HSV-1的减毒重组病毒，用编码几种病毒糖蛋白的HSV-2基因组区域取代了五个HSV-1基因[12]。除了RL1缺失，uL56缺失最有可能进一步降低神经毒力，因为pUL56与神经元特异性驱动蛋白(Kinesin Family, Member 1A，KIF1A)(一种涉及突触小泡前体的轴突运输的蛋白质)相关联，并通过缺失TK基因和基因UL24的启动子进一步减弱其毒性[13]。这些基因修饰使NV1020的毒性能够被极大减弱，并且使其仅在肿瘤细胞中传播。NV1020的安全性和有效性已经在胰腺癌，结肠癌，膀胱癌和胸膜癌中进行了检测。结合NV1020的细胞减弱毒性和肿瘤靶向性，已应用于临床治疗II期与III期试验。

G207是第一种用于临床试验的oHSV-1。它删除了两个拷贝的γ134.5并插入了大肠杆菌LacZ，衍生自HSV的TK在G207中是完整的，可通过联合用药治疗增强其抗肿瘤效果[14]。G207诱导全身抗肿瘤免疫，抗肿瘤免疫的效应与增强细胞毒性T淋巴细胞的活性有关[15]。 G47δ是来源于G207的一类HSV-1的突变体，删除了非必需基因α47，促进了G47δ的复制。此外，这类突变增加了MHC-I在感染细胞中表达，从而增强肿瘤抗原表达和抗肿瘤免疫应答[16]。G207和G47δ均可特异性的靶向肿瘤细胞，但G47δ具有更好的复制能力并且在肿瘤异种移植模型和众多肿瘤细胞系中表现出更强大的溶瘤能力[17]。

HF10在uL和uL/irL结合的右端具有3.9kbp的缺失，导致uL56表达的丧失。与野生型HSV-1相比，HF10毒力更低并且复制能力更前，其安全性和有效性在许多动物模型中得以证实，已被用于治疗卵巢癌、恶性黑素瘤、乳腺癌和胰腺癌的临床试验。最近的报告显示，HF10也对肿瘤复发性患者的肿瘤微环境产生作用，诱导细胞毒性T淋巴细胞产生抗肿瘤作用[18]，使其成为有潜力的OV，致力于晚期癌症治疗。

T-VEC的正式名称为OncovexGM-CSF，是HSV-1的基因工程改造菌株，其缺失了两个拷贝的ICP34.5基因和ICP47编码基因，插入了人粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)编码基因。OncovexGM-CSF通过直接肿瘤溶解和诱导肿瘤特异性再次免疫应答发挥抗肿瘤作用，包括增强抗原特异性T细胞应答、抑制CD4 +Tregs、CD8+Ts和骨髓来源的抑制性免疫细胞(MDSCs)的水平[19]。针对不可切除的晚期黑素瘤患者(OPTIM临床试验)III期临床试验，在晚期黑色素瘤的III期临床试验中，OncovexGM-CSF的客观反应率为26%，持续的反应率为16%，完全缓解率为11%[20]。

研究表明，与HSV-1相比，HSV-2可能在溶瘤方面存在一些优势，包括：(1)HSV-2的结构域可以激活RAS/MEK/MAPK通路，提高病毒繁殖效率；(2)HSV-2可以选择性感染肿瘤细胞并形成合胞体，可产生比HSV-1更好的抗肿瘤免疫应答；(3)死亡合胞体释放更多的合胞体，这使得树突状细胞更有效地工作，并诱导更强的抗原交叉呈递；(4)oHSV-2在减少肿瘤腹腔转移方面比oHSV-1更有效。

3 oHSV的抗肿瘤机制

由于在OV治疗后患者会产生抗肿瘤免疫反应，有时将OV治疗视为免疫疗法。这种反应是由许多因素造成的，如癌症抗原被放大，增加抗肿瘤免疫细胞的浸润，以及肿瘤的免疫耐受环境破坏等。因此，许多科学研究都致力于增强包括oHSV在内的OV治疗期间的免疫反应从而达到消除肿瘤细胞的目的。

癌细胞中基因突变的发现促进了基因治疗的发展，通过引入外源性基因来恢复、增强或抑制特定的靶基因。治疗基因包括自杀式基因、细胞因子、趋化因子、免疫刺激分子或肿瘤抑制基因等[21]。这些基因可招募、激活、增殖或分化免疫细胞，如自然杀伤性细胞(NK)、细胞毒性CD8+T(CTL)、辅助性CD4+T、树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞以及它们的祖细胞。病毒是高效的基因传递系统，通过基因修饰OV可产生更有效的抗肿瘤作用。HSV-1作为载体可以在其病毒基因组内引入较大的治疗基因，且目前已经成功地应用于递送各种免疫调节分子，包括白细胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)、IL-24(Interleukin-24，IL-24)、IL-4(Interleukin-4，IL-4)、IL-18(Interleukin-18，IL-18)和干扰素α(Interferonα，IFN-α)。这些转入的治疗基因通过刺激局部炎性或激发宿主免疫应答来抑制肿瘤生长。治疗性基因修饰HSV值得进一步探究其潜在的临床价值。

介导Th-1反应的IL-12显示出强的抗肿瘤活性。IL-12对CTL/辅助T淋巴细胞和NK细胞具有刺激作用。IL-12是免疫应答的中枢调节因子，可募集和激活NK和T细胞，还通过刺激来自辅助性T淋巴细胞的干扰素γ(Interferonγ，IFN-γ)分泌，从而具有抗血管生成的作用。携带IL-12的HSV对鳞状细胞癌显示出更加强烈的溶瘤作用。在鳞状细胞癌或微转移性肝病的鼠模型中，与其非IL-12表达的类似物NV1023相比，表达IL-12的NV1042显示出显着增强的抗肿瘤作用。此外，NV1042比表达GM-CSF 的NV1034效果更强。IL-24、IL-4和IFN-γ已被证明可通过抑制肿瘤血管发生、调节T辅助细胞成熟及调节肿瘤微环境来选择性诱导肿瘤细胞凋亡。所有上述转基因方法都可能产生抗肿瘤作用。然而，它们只能产生些特定的介质，产生特定的抗肿瘤作用，因此它们拥有的溶瘤功能是有限的。此外，这些治疗基因难以控制其产生细胞因子的量，存在细胞因子过度表达的风险，进而产生过度的副作用[22]。

实体肿瘤以不同的方式限制免疫治疗的有效性，例如免疫抑制细胞因子的分泌和免疫抑制配体的表达可抑制抗肿瘤T细胞的功能。OV通过联合PD-L1或PD-L2抑制剂，阻断程序性细胞死亡蛋白(programmed cell death protein-1，PD-1)信号通路，解除对T细胞的抑制,在许多类型的癌症试验中取得成功。研究数据表明PD-1抑制联合oHSV-1的治疗方法可能是儿童软组织肉瘤的有效治疗策略[23]。

肿瘤微环境的组成仍然是oHSV有效治疗癌症的障碍。大多数肿瘤拥有间质区域，高水平的胶原蛋白，以及非正常运行的淋巴系统，导致间质压力升高。尽管血管生长因子过度表达，但是这些肿瘤的血管系统是不完整的、不稳定的。通过这些肿瘤的血液流动使得到达癌细胞的药物量最小化，而丰富的细胞外基质也会抑制较大分子物质的通过，减弱了oHSV的疗效。硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans, CSPG)对细胞-细胞，细胞-细胞外基质相互作用至关重要。软骨素酶(Chase ABC)是一种细菌酶，可从CSPG中切割硫酸软骨素二糖链。有研究构建了突变的人源化版本的软骨霉素(ChaseM)，通过溶瘤HSV-1表达分泌ChaseM(OV-ChaseM)，与OV-control相比较，前者增强了病毒传播和对神经胶质瘤细胞的杀伤。OV-ChaseM加替莫唑胺组合治疗导致其对神经胶质瘤细胞的杀伤协同显着增强，伴随凋亡细胞死亡的增加。该研究验证了oHSV表达ChaseM和替莫唑胺破坏了细胞-细胞和细胞- ECM的相互作用，增强了胶质瘤细胞的化学治疗可用性和敏感性。也为减少细胞外基质在oHSV发挥抗肿瘤作用的局限性提供了新思路[24]。

化疗剂是用于治疗癌症的细胞毒性化学物质。这些药物通过增强应激条件(例如，DNA中的双链断裂，高水平的未折叠蛋白)进而促进细胞凋亡。然而，化疗剂是非特异性的，骨髓、消化道和毛囊中的正常细胞也可以响应于这些细胞毒性剂而导致细胞死亡。化疗的另一个限制是它通常需要功能性凋亡途径，然而在该途径中发生突变基因的癌细胞通常对化学疗法诱导的细胞死亡具有抗性。oHSVs可以通过与其组合起协同作用来减少药物治疗的局限性。治疗的顺序和时间、使用的oHSV突变体的类型和癌症类型等都是重要的考虑因素。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)化疗与最大安全切除术和放疗联合使用，是目前对胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者的临床治疗标准。面对这种联合治疗方法，GBM仍然会因为对化疗放疗的抵抗力，不可避免地引起复发，而复发性疾病的治疗效果普遍较差。研究显示oHSV-TRAIL(oHSV-TNF related apoptosis inducing ligand)有望克服GBM的治疗耐药性和复发性的能力，为其用于开展GBM治疗临床试验提供依据[25]。

4 HSV治疗的局限性

目前，各种OV都已经在临床治疗上有所应用，但是OV自身携带野生型病毒特征，优缺点并存。例如溶瘤性HSV-1、T-Vec和G47Δ，因为HSV-1从细胞扩散到血液会导致病毒血症，因此在临床治疗时不适合静脉注射。OV治疗另一个主要问题是循环抗体的存在可能会降低功效。对于这样的病毒，静脉给药对曾经接受过治疗或接种疫苗的患者的抗肿瘤作用是有限的。在使用溶瘤麻疹病毒(Measles virus encoding the human thyroidal sodium iodide symporter，MV-NIS)治疗多发性骨髓瘤患者的临床试验显示，只有在剂量水平达到很高之后，静脉滴注MV-NIS才会显示疗效。但是有最新研究表明，可以通过肿瘤内给药的方式提高靶向性，减少病毒毒性作用，且重复肿瘤内给药可以延长OV抗肿瘤作用并诱导持久的抗肿瘤记忆，这种记忆优于单独的肿瘤抗原暴露[26]。

在使用肿瘤免疫活性小鼠实验中，在肿瘤切除术后使用OV作为辅助治疗似乎是一种有吸引力的方法。现阶段，各种类型的OV均在临床上进行了阶段测试。认识OV与肿瘤微环境和免疫系统之间的相互作用对OV的改造及提高其安全性和抗肿瘤特性而言非常重要。对增强OV在体内溶瘤作用的机制以及影响OV在肿瘤微环境中传播的因素，目前均没有很确切的答案。另外，OV和常规疗法联合的临床抗肿瘤效果还有待更多的实验证实。用治疗转基因修饰HSV是癌症治疗中有希望的策略，可用于补充常规疗法的不足之处。然而，诸如OV的特异性和保持病毒复制受控的问题仍有待解决。随着各种研究不断地推进，有理由相信OV将会在肿瘤治疗中占有重要地位。