硬皮病及瘢痕疙瘩与硬化萎缩性苔藓患者LIGHT及其受体LTβR和HVEM病理生理学差异分析

王琳 唐海玲 胡志坤

[摘要]目的：分析硬皮病、瘢痕疙瘩与硬化萎缩性苔藓患者LIGHT及其受体LTβR、HVEM病理生理学意义的差异性。方法：选取2015年4月-2018年4月在笔者医院接受治疗并确诊为瘢痕疙瘩、硬化萎缩性苔藓和硬皮病的患者标本共60例，其中瘢痕疙瘩19例，硬皮病21例，硬化萎缩性苔藓20例，选取同期在笔者医院行整形手术的正常皮肤标本20例，免疫组化检测硬化萎缩性苔藓、瘢痕疙瘩、硬皮病及正常皮肤组织内LIGHT及其受体HVEM、LTβR表达状况。结果：正常皮肤组织真皮中能够看到微量表达的HVEM、LTβR，LIGHT在病变中是阴性;硬化萎缩性苔藓、瘢痕疙瘩及硬皮病患者真皮内均可看到LIGHT与其受体HVEM、LTβR蛋白表达，其主要表达于炎性细胞、成纤维细胞与血管内皮细胞包膜上，细胞膜为棕黄色或黄色;硬化萎缩性苔藓组、瘢痕疙瘩组及硬皮病组患者皮肤组织内HVEM、LTβR和LIGHT光密度值均高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：硬化萎缩性苔藓、瘢痕疙瘩及硬皮病起病与进展中可能有LIGHT及其受体HVEM、LTβR参与，但具体路径和参与形式仍需进一步探究。

[关键词]硬化萎缩性苔藓;瘢痕疙瘩;硬皮病;LIGHT;受体LTβR;受体HVEM

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）02-0080-03

Abstract： Objective  To analyze the difference of pathophysiological significance between LIGHT and its receptor LTβR and HVEM in patients with scleroderma， keloid and sclerosing atrophic moss. Methods  A total of 60 patients with keloids， sclerosing atrophic moss and scleroderma were enrolled in our hospital from April 2015 to April 2018， including 19 patients with keloid specimens and scleroderma specimens. Twenty-one patients with sclerosing atrophic moss specimens were enrolled in the study. Twenty patients with normal skin specimens underwent plastic surgery in the same period. Immunohistochemistry was used to detect LIGHT and its receptors in cirrhotic atrophic moss， keloid， scleroderma and normal skin tissues. HVEM， LTβR expression status. Results  HVEM and LTβR， LIGHT were negative in normal skin tissue dermis， and LIGHT and its receptor HVEM and LTβR protein expression were observed in dermis of patients with sclerosing atrophic moss， keloid and scleroderma. It is mainly expressed on the envelope of inflammatory cells， fibroblasts and vascular endothelial cells， and the cell membrane is brownish yellow or yellow; HVEM， LTβR and LIGHT optical density in the skin tissue of patients with sclerotic atrophic moss， keloid group and scleroderma group The values were higher than the normal group（P<0.05）. Conclusion  LIGHT and its receptors HVEM and LTβR may be involved in the onset and progression of cirrhotic atrophic moss， keloid and scleroderma， but the specific path and form of participation still need to be further explored.

Key words： sclerosing atrophic moss; keloid; scleroderma; LIGHT; receptor LTβR; receptor HVEM

硬皮病為临床多见的一种结缔组织疾病，主要特征为内脏和皮肤纤维化，患者发病机制包含多因素，而感染和自身免疫等因素在硬皮病的发生和进展中有重要作用。硬化萎缩性苔藓为炎症性慢性疾病，可导致内脏或皮肤出现硬化与纤维化，自身免疫等因素与患者的发病有一定联系[1-2]。瘢痕疙瘩为胶原纤维异常聚集所导致的瘢痕疾病，其发病因素和细胞凋亡失调、伤口张力及遗传等因素有关，胶原和成纤维细胞异常沉积在瘢痕疙瘩形成中有重要作用。LIGHT为肿瘤坏死因子超家族内主要成员，还可称为TNFSF14，为淋巴毒素类似物。LIGHT及受体LTβR、HVEM在临床多种疾病内有重要生物学影响，特别是自身免疫性疾病。LIGHT可参加组织重塑与纤维化，与结构或炎症细胞内受体相互影响而参加部分促纤维因子表达，并加速胶原等细胞外基质蛋白沉积[3-4]。在临床上，如瘢痕疙瘩、硬化萎缩性苔藓和硬皮病等一些结缔组织增殖或皮肤纤维化等疾病，是否与LIGHT及受体LTβR、HVEM有关，目前相关研究较少。因此，本研究经过分析硬皮病、瘢痕疙瘩及硬化萎缩性苔藓患者LIGHT及其受体LTβR和HVEM病理生理学差异性，为临床诊疗提供思路。

1  材料和方法

1.1 病例资料：选取2015年4月-2018年4月于笔者医院接受治疗并确诊为瘢痕疙瘩、硬化萎缩性苔藓和硬皮病患者的组织标本共60例，排除合并其他慢性系统性或皮肤疾病者。其中瘢痕疙瘩标本19例，年龄25～66岁，平均（42.18±6.31）岁，男10例，女9例;硬化萎缩性苔藓标本20例，年龄22～68岁，平均（43.61±6.83）岁，男11例，女9例;硬皮病标本21例，年龄24～64岁，平均（41.65±6.50）岁，男10例，女11例。选取同期在笔者医院行整形手术的正常皮肤标本20例，年龄在20～55岁，平均（39.28±6.21）岁，四组对象临床资料差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者或家属知情并签署同意书。

1.2 试验试剂与仪器：试剂：无水乙醇、脱蜡透明剂、中性树胶（购自上海国药公司），鼠抗LIGHT单克隆抗体、兔抗HVEM多克隆抗体及兔抗LTβR多克隆抗体（美国Abcam公司），柠檬酸抗原修复液、PBS缓冲液（迈新生物技术公司），苏木素、DAB试剂盒（迈新生物公司）。仪器：烘片机（龙首电子仪器公司），电热恒温水浴箱（德国Eplpendorf公司），转轮式切片机（型号：莱卡-2016，德国莱卡公司），低温冰箱（德国Ultra-low公司），推片机（龙首电子仪器公司），蒸汽高压消毒箱（德国Tuttnauer公司），图像分析仪（美国Metarnprph Image System V4.6VIC），光学显微镜（日本OlyrnpusCH-2），微量移液器（德国Eplpendorf公司）。

1.3 研究方法：①脱蜡及水洗，在60℃烤箱内将石蜡切片烘烤1h，切片取出后在脱蜡透明剂Ⅰ内浸泡15min，在脱蜡透明剂Ⅱ内浸泡15min，切片于梯度酒精内浸泡，采用PBS溶液冲洗3次，1次/5min;②柠檬酸盐抗原修复液倒入器皿内，置入切片，高壓锅冒气后计时1.5min，容器取出后冷却，PBS溶液冲洗3次，1次/5min;③加入3% H2O2的去离子水50ml，放置10min，PBS溶液冲洗3次，1次/5min;④将山羊血清封闭液50ml滴入切片组织上，室温下放置30min;⑤多余封闭液甩去，滴入Ⅰ抗50ml，切片放入湿盒内，在4℃下过夜;⑥14h后将湿盒取出，置入37℃的水浴锅内，PBS溶液清洗3次，1次/5min;⑦加入50ml Ⅱ抗，孵育10min后使用PBS溶液冲洗3次，1次/5min;⑧切片内滴加50ml的辣根酶标记链霉卵白素液，室温下静置8min，PBS溶液冲洗3次，1次/5min;⑨行DAB染色，显微镜下观察其显色状况，放置蒸馏水内显色中止;⑩切片取出后擦干，滴入50ml苏木素复染色，自来水冲洗，盐酸-乙醇分化，梯度酒精后置入二甲苯内透明，中性树胶封片。组织细胞膜经过染色后，表征为棕黄色或黄色判定阳性。正常和各组患者皮肤组织内LIGHT及其受体表达状况采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，一个切片随机选取5个视野，检测表皮下积分的光密度数值和皮下面积，计算平均光密度值。

1.4 统计学分析：采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料（x?±s）表示，行t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1 各组患者免疫组化检测结果：在正常皮肤组织真皮中，可看到微量表达的HVEM、LTβR，LIGHT是阴性。硬皮病患者真皮内均可看到LIGHT及其受体HVEM、LTβR蛋白表达，主要表达于炎性细胞、成纤维细胞与血管内皮细胞包膜上，细胞膜为棕黄色或黄色;瘢痕疙瘩患者真皮内均可看到LIGHT及其受体HVEM、LTβR蛋白表达，主要表达于炎性细胞、成纤维细胞与血管内皮细胞包膜上，细胞膜为棕黄色或黄色;硬化萎缩性苔藓患者真皮内均可看到LIGHT及其受体HVEM、LTβR蛋白表达，主要表达于炎性细胞、成纤维细胞与血管内皮细胞包膜上，细胞膜为棕黄色或黄色。

2.2 各组患者皮肤组织内HVEM、LTβR和LIGHT光密度值：硬化萎缩性苔藓组、瘢痕疙瘩组及硬皮病组患者皮肤组织内HVEM、LTβR和LIGHT光密度值均高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

3  讨论

硬皮病为结缔组织疾病，临床可分成系统性与局限性硬皮病，关于其病因目前尚未完全明确，有多重信号通路、细胞因子等参与，可能与自身免疫、遗传、病毒感染、创伤及药物等有关[5-6]。有研究显示硬皮病患者发病中，TGF-β信号路径可对纤维细胞起刺激作用而形成大量胶原蛋白，并最终生成纤维化[7-8]。硬化萎缩性苔藓为慢性炎症性疾病，能够导致内脏或者皮肤出现硬化与纤维化，并进展萎缩。LIGHT能够结合其受体DcR3、HVEM及LTβR而起到不同生物学效应，如肿瘤与多种自身免疫系统疾病的出现与进展中都有LIGHT及其受体的参与，LIGHT可结合其受体参加TSLP、TGF-β等加速纤维化因子表达，从而起到重塑与加速纤维化作用。LIGHT可刺激角质而产生细胞，同时可发现有高表达的TSLP，最后导致皮肤进展为特应性皮炎样或硬皮病特征[9-12]。

本研究显示正常皮肤内受体HVEM、LTβR为弱阳性表达，LIGHT则为阴性表达，说明在硬化萎缩性苔藓、瘢痕疙瘩、硬皮病发病中可能有LIGHT及其受体参与。不同疾病中LIGHT所起的影响有显著性差异，这主要与LIGHT受体在不同疾病状况下的表达有差异相关。相关研究显示，正常人牙龈的成纤维细胞内LIGHT没有表达，但在牙龈疾病患者成纤维细胞内可检测LIGHT高表达，由此可推测，出现疾病可能与牙龈成纤维细胞内LIGHT表达有关[13-14]。皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的进展和LIGHT表达有联系，伴随患者疾病进展，阳性表达的LIGHT淋巴细胞数量变多，HVEM则能够在血液肿瘤细胞或者皮损真皮成纤维细胞内表达。前期CTCL的皮损成纤维细胞内HVEM为高表达，晚期CTCL患者成纤维细胞内表达下降，但LTβR的含量却无显著改变[15-16]。本研究对LIGHT及其受体表达进行了横向对比，结果显示，硬化萎缩性苔藓患者其皮肤组织内LIGHT蛋白的表达量最高，而在瘢痕疙瘩患者内最低;硬化萎缩性苔藓者其皮肤组织内HVEM蛋白表达量最高，而在硬皮病患者内最低;瘢痕疙瘩者皮肤组织内LTβR蛋白表达量最高，而在硬化萎缩性苔藓患者最低。由此可知上述三种疾病中LIGHT及其受体表达含量有一定的差异，可能与疾病进展阶段不同或疾病种类不同有关。

综上所述，硬化萎缩性苔藓、瘢痕疙瘩及硬皮病起病与进展中可能有LIGHT及其受体HVEM、LTβR参与，但其具体路径和参与形式仍需更进一步探究。

[参考文献]

[1]曹朝晖，董世访，江伟凡，等.自身免疫疾病中的LIGHT-LTβR/HVEM信号通路的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2011，27（12）：1382-1384.

[2]Basdevant N，Borgis D，Ha-Duong T.Modeling protein-protein recognition in solution using the coarse-grained force field SCORPION[J].J Chem Theory Comput，2013，9（1）：803-813.

[3]Etoh M，Jinnin M，Makino K，et al.microRNA-7 down-regulation mediates excessive collagen expression in localized scleroderma[J].Arch  Dermatol Res，2013，305（1）：9-15.

[4]李彬彬，史菲.肿瘤坏死因子超家族成员14在哮喘中的研究进展[J].免疫学杂志，2017，11（7）：629-633.

[5]李权，李涛，李瑞鹏，等.CD258（LIGHT）在腫瘤免疫治疗中的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2016，32（1）：118-121.

[6]Canady J，Arndt S，Karrer S，et al.Increased KGF expression promotes fibroblast activation in a double paracrine manner resulting in cutaneous fibrosis[J].J Invest Dermatol，2013，133（3）：647-657.

[7]李桂清，尚宇航，曹朝晖，等.TNFSF14及其受体LTβR和HVEM在病毒肝炎中的作用[J].中国免疫学杂志，2015，31（12）：1591-1594.

[8]He Y，Yue Y，Zheng X，et al.Curcumin，inflammation，and chronic diseases：how are they linked？[J].Molecules，2015，20（5）：9183-9213.

[9]邹颖，王学民，顾军.肿瘤坏死因子超家族成员LIGHT及其受体研究进展[J].医学综述，2015，16（21）：3902-3905.

[10]Ogawa R，Hsu CK.Mechanobiological dysregulation of the epidermis and dermis in skin disorders and in degeneration[J].J Cell  Mol  Med，2013，17（7）：817-822.

[11]周佳鑫，徐东，侯勇，等.系统性硬化病合并肾危象16例临床分析[J].中华内科杂志，2015，54（2）：125-129.

[12]刘玲玲，张文，刘滨磊，等.表达单纯疱疹病毒受体HVEM的黑色素瘤B16-ova-HVEM细胞系的构建及成瘤后oHSV2治疗效果初探[J].癌症进展，2016，14（10）：962-965.

[13]Canady J，Karrer S，Fleck M，et al.Fibrosing connective tissue disorders of the skin： molecular similarities and distinctions[J].J Dermatol Sci，2013，70（3）：151-158.

[14]鲁佳莹，吴文育.局限性硬皮病发病机制的研究进展[J].国际皮肤性病学杂志，2015，41（2）：100-102.

[15]刘心娟，高娜，李梦涛，等.系统性硬化病患者外周血中调节性T细胞与辅助性T细胞17平衡关系的变化[J].中华风湿病学杂志，2016，20（3）：148-153.

[16]Park SY，Park JY，Kim CH，et al.Effects of Xanthium stramarium and psoralea corylifolia extracts combined with UVA1 irradiation on the cell proliferation and TGF-β1 expression of keloid fibroblasts[J].Ann  Dermatol，2013，25（3）：304-309.