雷公藤新碱对LPS诱导小鼠骨髓树突状细胞成熟分化过程及炎症因子分泌的影响

张 伟 闫越颖 王政洁

(菏泽市立医院皮肤科，菏泽274000)

自1936年首次发现雷公藤红素以来，人们在卫矛科雷公藤属植物雷公藤中已分离得到生物碱、萜类及多糖等有效成份100余种[1,2]。既往研究表明雷公藤具有抗炎及免疫抑制作用，在类风湿关节炎、器官移植、肿瘤等疾病治疗中具有显著疗效[3，4]。近期研究发现，雷公藤能够阻止淋巴细胞增殖，诱导活化的淋巴细胞凋亡，对T细胞具有显著的抑制作用[5，6]，但详细机制不明；树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是调控免疫系统最强细胞之一，其成熟后在T细胞激活过程中发挥关键作用，是机体激活T细胞的最重要因素[7]。

雷公藤生物学成份复杂，其生理活性成份主要为二萜内酯、生物碱、三萜等。其中生物碱包括雷公藤精碱(Wilforgine)、雷公藤新碱(Euonine)、卫矛碱(Euonymine)等[8]。雷公藤新碱分子式为C38H47NO18，作为雷公藤重要的活性成分之一，是否具有与雷公藤相似的药理学作用及其详细作用机制，有待进一步探讨。本研究通过流式细胞术与抗体芯片技术检测雷公藤新碱对LPS诱导树突状细胞(Dendritic cells，DCs)成熟过程中表面分子变化、抗原吞噬能力及细胞因子分泌的变化，以探明雷公藤新碱对DCs成熟过程影响的具体作用机制，为临床应用雷公藤治疗自身免疫性等炎症相关疾病找到理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 流式细胞仪购自BD公司(Aria2，BD,USA)，雌性C57BL/6小鼠购自山东大学动物实验中心，RPMI1640培养基购自Gibco公司，无钙镁的Hank′s平衡盐溶液购自Hyclone公司，rmGM-CSF购自瑞典ProSpec公司(#cyt-720)，rmIL-4购自美国R&D公司(# 404-ML-010)，LPS购自Sigma公司(#L2630)，MHCⅡ、CD80、CD86等流式抗体购自BD公司，抗体芯片购自Abcam公司(#Ab133995)，雷公藤新碱购自南京景竹生物科技有限公司(# 37239-48-8)。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓DCs的获取 将C57BL/6小鼠颈椎脱位法处死，取出股骨与胫骨浸泡在RPMI1640培养中，用1 ml培养基冲洗骨髓腔中的骨髓，收集骨髓悬液，离心弃上清；加入细胞沉淀体积3倍量Tris-NH4Cl溶液室温裂解红细胞，离心弃上清，PBS洗涤2～3次；使用RPMI1640培养基重悬细胞，以细胞密度2×106ml-1接种于75 cm2培养瓶中，依次加入 rmIL-4 、mGM-CSF(工作液浓度为10 ng/ml)，37℃、 5%CO2培养48 h，每隔一天半量换新鲜培养基，培养5 d，流式细胞仪检测树突状细胞纯度。

1.2.2DCs成熟过程中MHCⅡ、CD80、CD86分子标志检测 获取小鼠骨髓DCs后，以6×105ml-1细胞浓度分别接种于无菌的A、B培养板中；A培养板加入终浓度1 μg/ml LPS，37℃、5%CO2培养48 h；B培养板加入终浓度1 μg/ml LPS与雷公藤新碱(工作浓度为40 ng/ml)混合液，37℃、5%CO2培养48 h；常规消化细胞后，向流式管中加入50 μl细胞悬液与1 μl抗小鼠MHCⅡ、CD80、CD86标志的荧光抗体，另取一支流式管加入50 μl细胞悬液作为空白对照；轻柔混匀后室温避光静置45 min，PBS洗涤2次；流式细胞术检测DCs表面相关分子表达量变化。

1.2.3DCs抗原吞噬能力检测 取上述A、B两板中约一半细胞加入浓度为1 mg/ml的FITC-dextran，继续培养1 h后收集细胞，调整细胞浓度至1×105ml-1，800 r/min离心5 min，弃上清后PBS洗2遍，流式细胞仪检测DCs吞噬能力变化，同时以未处理细胞作为阴性对照。

1.2.4抗体芯片检测 收集A、B两板DCs细胞培养上清液；取出抗体膜置于反应盒中，向反应盒中缓慢加入2 ml 1×封闭液，室温孵育30 min；弃去封闭液，轻轻加入1 ml 样品液，室温孵育1～2 h；去除样品液，依次用2 ml 1×洗液Ⅰ、2 ml 1×洗液Ⅱ，各洗膜3次×5 min；用2 ml 1×封闭液溶解抗体管中的生物素，配成一抗反应液备用；向反应盒中加入1 ml上述一抗反应液，室温孵育1～2 h；洗掉多余抗体；用1×封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗链酶生物素抗体，向反应盒中加入上述稀释液2 ml，室温孵育2 h；洗膜；各取ECL试剂盒中A、B液250 μl，混合均匀备用；将反应盒中的膜取出，置于保鲜膜上，加入染色液并采集数据。

1.3统计学方法 本实验使用Graphpad Prism7.0软件进行统计学分析(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)。数据采用t检验，当P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1雷公藤新碱影响LPS诱导DCs成熟过程 加入雷公藤新碱组中DCs表面的协同刺激分子MHCⅡ、CD80、CD86的表达量与对照组相比明显降低。结果如图1所示，MHCⅡ分子实验组55.3%，对照组66.7%；CD80实验组36.4%，对照组62.4%；CD86实验组36.5%，对照组60.2%，每组分别进行3次独立实验。以上结果表明雷公藤新碱可降低LPS诱导DCs成熟过程。

2.2雷公藤新碱增强 DCs抗原吞噬能力 实验结果如图2所示，与对照组相比，雷公藤新碱组吞噬FITC-Dextran的DCs比值增多，结果有统计学意义(P<0.01)。

图1 雷公藤新碱降低LPS诱导DCs表面MHCⅡ、CD80、CD86表达量

图2 雷公藤新碱增强DCs吞噬能力

表1雷公藤新碱作用后细胞因子分泌变化

Tab.1Changesofcytokinesecretionaftereuonineadministration

CytokinesFull nameLPS groupLPS+euonine groupP valueIL-13Interleukin 1345.55±3.6038.80±2.990.05IL-15Interleukin 15141.20±12.63115.17±8.900.05IL-1αInterleukin 1 Alpha114.74±7.2072.73±10.230.01IL-1βInterleukin 1 Beta 35.97±3.8016.88±4.550.001IL-2Interleukin 2 115.44±8.73105.02±9.560.08IL-3Interleukin 333.17±4.3235.88±5.100.12IL-4Interleukin 4 27.34±4.3334.72±2.740.08IL-6Interleukin 6 105.13±11.30110.41±14.570.11IL-7Interleukin 7 18.68±2.3011.97±4.390.05IL-8Interleukin 8 135.65±5.00221.63±14.300.01APC-1Antigen Presenting Cells 1990.22±72.89547.50±29.500.01APC-2Antigen Presenting Cells 265.80±10.7424.07±6.980.001M-CSFMacrophage Colony Stimulating Factor160.00±18.00136.50±22.800.01MIP-1αMacrophage Inflammatory Protein 1 Alpha103.80±17.3046.23±5.600.001MIP-1βMacrophage Inflammatory Protein 1 Beta1 054.38±58.601 014.83±78.110.26MIP-1δMacrophage Inflammatory Protein 1 Delta268.17±44.30361.87±26.890.05TGF-β1Transforming Growth Factor Beta 187.83±21.30110.85±37.200.05

图3 小鼠抗体芯片检测结果

2.3雷公藤新碱降低LPS诱导DCs上清中细胞因子分泌水平 检测结果如表1和图3所示，与对照组相比，雷公藤新碱实验组可降低大部分细胞因子分泌水平，特别是APC-2、MIP-1α及IL-1β的表达水平较对照组明显降低。实验重复3次，结果显示差异有统计学意义。

3 讨论

DCs主要有DC1、DC2两种亚型，其中DC1主要由细菌LPS、病毒等诱导产生，DC2则主要由IL-1、肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导产生[9]。DCs的起源、表型以及亚型的异质性与多样性决定了它复杂的生物学特性，体内多以不成熟DCs存在，不成熟的DCs具有较强的胞饮、吞噬及受体介导摄取抗原的能力，但几乎没有抗原递呈的能力，且不能激活T淋巴细胞和免疫应答，其表面低表达共刺激分子、限制性标志分子与MHC分子等。当不成熟DCs由中枢淋巴器官、初级淋巴器官向外周、次级淋巴结迁移时，伴随着DCs形状、细胞表面分子数目及细胞因子受体形态的改变，逐渐演变为成熟的DCs。成熟的DCs高表达上述分子，同时上调趋化受体，大量分泌IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-12等细胞因子[10]。成熟的DCs具有极强的抗原呈递能力、可刺激淋巴T细胞活化增殖，启动免疫应答，参与T细胞介导的特异性免疫应答[11]。DCs是唯一能激活初始T细胞(naive T cell,Tn)的抗原呈递细胞，Tn活化以后分化成Th1、Th2、Th7以及调节性T细胞，Th1/Th2动态平衡是维持正常免疫状态的关键，Th1/Th2比例失衡将会诱导炎症性疾病的发生，因此DCs可通过该途径参与多种疾病的发生发展进程[12]。

本研究发现小鼠骨髓DCs在加入雷公藤新碱后与单独LPS诱导组相比，其表面分子MHCⅡ、CD80、CD86均明显降低。LPS作为抗原成份刺激DCs成熟，使其共刺激分子、表面分子表达上调，从而有效激活T细胞诱导免疫应答[13]。以上结果表明雷公藤新碱能够抑制DCs成熟，随后我们又对DCs进行了抗原吞噬能力检测，同样发现雷公藤新碱干预后，DCs吞噬能力比未干预组显著增强，该结果进一步表明雷公藤新碱可抑制LPS诱导DCs成熟作用，提示雷公藤可能通过抑制DCs成熟进而抑制T细胞参与机体免疫应答过程。

同时，本实验利用抗体芯片技术发现雷公藤新碱干预组与对照组相比，IL-4、IL-8、MIP-1δ等细胞因子表现为细微上调现象，其他因子相对于对照组表达水平均有所下降。DCs细胞成熟一般需要共刺激分子的表达及细胞因子表达的上调[14]，LPS则主要通过与TLR4受体结合促进细胞分泌细胞因子。本研究中雷公藤新碱调控大部分TLR4通路细胞因子表达下调，表明雷公藤新碱可能通过TLR4信号通路调控DCs成熟过程，但详细机制需进一步进行研究。与对照组相比APC-2、MIP-1α及IL-1β减少量尤为明显，APC-2、MIP-1α及IL-1β等细胞因子主要激活CD4+Th1细胞亚群，导致炎症的产生；而IL-4、IL-8、MIP-1δ等细胞因子主要激活CD4+Th2细胞亚群从而抑制炎症。因此，我们的结果进一步表明雷公藤新碱影响DCs的成熟过程，也提示雷公藤新碱具有有效地抗炎作用。

DCs具有极强的抗原提呈能力，在免疫应答及免疫耐受中具有重要的作用。相信随着研究的不断深入，DCs终将成为治疗皮肤病等各种炎症性疾病、自身免疫病等疾病的重要作用靶点。雷公藤是临床应用中非常重要的免疫抑制药物，对免疫调节具有明显的抑制作用及抗炎作用，已在临床应用取得了可喜的成果。但雷公藤成分复杂，免疫调控机制尚不明确以及毒副作用较强，在如何取得单一有效的成分、降低毒副作用的发生等领域仍存在许多值得深入探讨的问题。本研究发现雷公藤新碱作为雷公藤的重要组成分之一，可以有效抑制DCs的成熟过程，提示可能在DCs及T细胞参与的免疫性疾病中发挥关键作用，因此，本研究具有十分重要的理论与实践意义。