一株大蒜根际细菌特性研究及其对田间大蒜产量和土壤酶活性的影响

崔 曼，尹彦舒，张梦琦，卜 宁，陈云云，高 淼*，马莲菊*

（1．沈阳师范大学生命科学学院，辽宁 沈阳 110034；2．中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081）

植物根际促生细菌（PGPR）是定殖在植物根部周围，具有促进植物生长，增加植物产量，抵抗植物病害等功能的一类有益菌群［1-2］。大部分PGPR具有生物固氮、溶磷、产生植物激素和分泌抗生素等特性及生防作用或其中之一的某种特性［3］。根际环境中，植物与微生物形成的有益关系可使植物健康生长并且维持土壤肥力［4］。近年来植物根际促生菌的筛选成为研究热点［5］。到目前为止关于PGPR的报道遍布国内外，其中包括常见的芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮菌属（Azotobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、不动杆菌属（Acinetobacter）等［1-2，6-10］。大蒜是一种忌连作的蔬菜，作物连作是导致大蒜品质和产量下降的主要因素。连作障碍产生的主要原因是由于土壤养分元素的不均衡、化感物质积累、土壤微生态及微生物区系变化等方面导致的［11］。前人研究发现，大蒜连作15～20年后，可导致土壤中酶活性降低，产生明显的连作障碍现象［12］。连作障碍产生后，大蒜根腐病的发病情况也随之增加［13］。本研究中的根际细菌为前期实验室人员在山东省金乡县大蒜田中收集的连作大蒜根际土壤，在连作土壤中分离获得的根际细菌。筛选出对大蒜根腐病和其他植物上的病害病原菌具有拮抗作用的菌株进行功能特性、田间增产及对土壤有改良作用的菌株，为更好的改善土壤，解决大蒜产量及病害等多重问题发掘潜在菌株。

1 材料与方法

1.1 供试材料

根际微生物：连作大蒜根部中分离纯化的细菌。

大蒜根腐病病原真菌：H5（Setophoma terrestris）为前期实验室人员在有根腐病的大蒜根部分离得到的大蒜病原真菌，H9（Fusarium solani）由中国农业微生物菌株保藏中心提供。

1.2 培养基

对峙检验：PDA 培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1 L，琼脂 15 ～ 20 g，pH 值 7.0。

产 HCN 能力检验：King’s B 培养基：MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，甘油 10 mL［14］，1.8% 琼脂，蛋白胨 20 g，pH 值 7.2。

产蛋白酶能力检验：蛋白酶检测培养基［14］。

溶解磷能力检验：溶解有机磷能力：有机磷卵黄培养基［14］；溶解无机磷能力：无机磷培养基［14］。

IAA能力测定：DF培养基［14］。

ACC 能力测定：ADF 培养基［14］。

固氮能力检验：无氮培养基［15］。

1.3 测定菌株对病原真菌的拮抗能力

采用两点对峙法［16］。在PDA平板上，用直径5 mm打孔器取大蒜根腐病病原真菌菌饼接于距离平板圆2 cm处的一点上，在同一直线距圆心等距反方向的另一点上滴加 2 μL待测菌液，每组设置3个重复。H9及处理置于28℃恒温培养箱中培养7 d，H5及处理置于28℃恒温培养箱中培养14 d，测定抑菌半径，计算抑菌率。

抑菌直径和抑菌率计算公式：

抑菌直径=对照菌落直径-处理菌落直径

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100

1.4 菌株16S rRNA基因序列测定

1.4.1 菌株16S rDNA的PCR扩增

取单菌落，于装有100 μL 无菌水的EP管中混匀，95℃水浴15 min后，于-20℃冰箱冷冻1 min，12 000 r/min 条件下离心 2 min，4℃冰箱保存，模板为上清液［14］。PCR 扩增引物采用通用引物。扩增后的样品送往北京生工有限公司进行测序，在EzTaxon数据库上将获得的序列进行序列比对。

1.4.2 菌株gyrB基因的PCR扩增

采用细菌DNA试剂盒方法提取菌株DNA，引物为：UP-1和UP-2r。反应过程为：95℃ 5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 2 min，30 个循环，72℃ 10 min。扩增后的样品处理同 1.4.1。

1.5 菌株促生特性测定及方法

1.5.1 溶解磷能力测定

收集了2 μL的细菌悬浮液，然后将其接到有机磷和无机磷培养基中。Ca3（PO4）2作为无机磷源，新鲜蛋黄溶液作为有机磷源。每组3次重复，放入培养箱28℃，14 d。是否有透明圈围绕形成，来判定其是否具有溶解磷的能力。

1.5.2 固氮能力测定

挑取单菌落在无氮平板上划线，28℃培养，在第3 d时观察平板上菌株生长状况，菌落可在无氮培养基中生长表示其具有固氮能力。对有固氮能力的细菌进行乙炔还原法测定固氮酶活性［17］。并对具有固氮酶活性的菌株进行nifH基因的扩增，反应过程为：95℃ 1 min。58℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35个循环。

固 氮 酶 活 性［nmol/（mg·h），protein］=C2H4（nmol）/［菌体蛋白量（mg，protein）× 反应时间（h）］。

1.5.3 IAA能力测定

IAA产生的能力用比色法测定［18］。在DF培养基中接种菌株生长24 h后转移到含有0.1% L色氨酸的DF培养基中。置于28℃培养箱中，7 d后，8 000 r/min 离心 10 min。

悬浮液与Fe-H2SO4溶液（1∶2）混合，暗室放置45 min，通过测量450 nm处样品吸光度和标准吸光度，绘制标准曲线。

1.5.4 ACC脱氨酶活性菌株的筛选

参考 Glick［19］的方法，在 5 mL固氮液体培养基上接入菌种，28℃ 200 r/min条件下振荡培养1 d，吸取0.1 mL悬浮液至5 mL的DF培养基中，同条件继续培养1 d后，吸取0.1 mL悬浮液至5 mL的ADF培养基中，同条件继续培养1～2 d。将可在ADF培养基中生长的菌种再转接一次，用不含ACC的ADF培养基为阴性对照。分别以不接菌的ADF和不含ACC的ADF培养基为对照，测定600 nm处菌液的吸光度值，确定ACC脱氨酶的阳性菌株。

1.5.5 产铁载体能力检测

采用蓝色定性检测培养基对菌株产铁载体能力进行定性测定［20］。在CAS试验板上能产生橙色晕圈的菌株被鉴定为可产铁载体的阳性菌株。具有产铁载体能力。

1.6 田间接种

在田间小区（每个小区6 m2）中设置2组试验：第一组：施用DS7菌剂；第二组：不施用DS7菌剂的对照组。每块小区前后间隔5 m，每组试验进行3个平行重复。

1.7 土壤样品采集和酶活性测定

用蛇形5点采样法，在田间小区中采集5～20 cm土样，用于土壤酶活性的测定。播种前在小区内随机取样，采集大蒜根际土壤样品。

采用高锰酸钾滴定法测定土壤过氧化氢酶活性；采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定脲酶活性；土壤蔗糖酶活性用3，5-二硝基水杨酸比色法测定［21］。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的筛选

供试根际细菌为前期在山东省金乡县大蒜田中采集的连作大蒜根际土壤中分离纯化的细菌，在PDA培养基上进行对峙实验，经两点对峙实验，发现菌株DS7对两种大蒜根腐病病原真菌均有拮抗效果，DS7对H5（Setophoma terrestris）抑制率达到 51.72%，对 H9（Fusarium solani）抑制率达到42.31%（图 1）。

图1 菌株DS7对大蒜根腐病病原真菌的拮抗能力

2.2 菌株DS7的16S rRNA基因序列分析

将菌株DS7基于16S rDNA获得的基因序列和基于gyrB获得的基因序列，分别与相近种属的基因序列在EzTaxon数据库中进行比对后，根据邻近法则结合MEGA 7.0软件建立系统发育进化树，如图2、图3。结合其菌落形态确定菌株DS7为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）［22］。

图2 基于16S rDNA基因序列构建菌株DS7系统发育进化树

图3 基于gyrB基因序列构建菌株DS7系统发育进化树

2.3 菌株DS7的功能特性研究

菌株DS7能在蛋白酶检测平板上出现明显透明水解圈，表明其具有蛋白水解能力；在 King’s B 培养基上，含菌株DS7的滤纸出现深黄色变化，说明其具有产HCN能力；菌株DS7可以使CAS 蓝色检测液产生橘黄色透明圈，说明其具有产铁载体能力。DS7具有产铁载体的能力；具有溶解有机磷和无机磷的能力；具有水解蛋白能力；有产IAA能力；不具有产生ACC脱氨酶的能力，结果如表1所示。菌株DS7在平板上的情况，如图4所示。

表1 菌株Bacillus sp. DS7的功能机制

图 4 菌株 Bacillus sp. DS7 的功能特性

DS7可以在无氮培养基中培养，其固氮酶活性为（0.41±0.09）nmol/（mg·h）；菌株和阳性对照固氮菌株的固氮酶nifH基因扩增结果如图5所示。从分子学角度上再一次确定菌株DS7为固氮菌，具有固氮能力。

图5 菌株 Bacillus sp. DS7固氮酶nifH基因的PCR扩增结果

2.4 接种菌株DS7对田间大蒜产量的影响

田间测产结果如表2，施用DS7菌剂后大蒜的产量比不施用任何产品的对照组的大蒜产量增加约15.42%。

表2 田间测产结果

2.5 接种菌株DS7对田间大蒜根际土壤酶活性的影响

测量接种菌株DS7后土壤中的蔗糖酶活性、过氧化氢酶活性和脲酶活性3种指标检测土壤酶活性。接种DS7菌液后，土壤蔗糖酶活性相对于对照组提高12.95%，可见接种DS7菌液后土壤肥力有所提高并改善。过氧化氢酶活性并没有提高，反而降低2.75%，土壤中微生物的生命活动速度减慢，可能因为接种DS7后会抑制土壤中其他微生物的活动。接种DS7可加速氨的生成，与对照组相比增长率为6.80%，结果见表3。

表3 土壤酶活性结果

3 结论与讨论

植物根际促生菌（PGPR）在植物生长过程中对植物生长来说是一类有意义的菌群，PGPR在植物的根茎或根表面定殖，通过吸收矿物质的方式来帮助植物快速生长［23］。目前常用的根际微生物是具有生物防治功能的促生菌［24］，例如：假单胞菌属（pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和农杆菌属（Agrobacterium），这些微生物大多具有防病促生功能，可以有效用于防治植物病害。部分PGPR在对植物促生时可对土壤进行修复［25］，所以在肥料开发的过程中充分利用PGPR的功能特性是解决田间植物生长、土壤修复等问题的一种环保的方法。在实际生产中已出现商家利用PGPR做成肥料并投入生产的情况［26］。芽孢杆菌属主要应用在田间农蔬作物，前期对种子进行处理，可防治各种苗期出现的病害［27］。王娜娜［28］从白皮大蒜中共分离出62株内生菌对4种病原菌都具有拮抗作用，其中芽孢杆菌属的数量占到84.2%。解淀粉芽孢杆菌对果蔬上的病原菌有很好的防治效果，例如：山茶灰斑病，猕猴桃灰霉病等［29-30］。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有抑制真菌和细菌的活性的作用，与菌株在生长过程中产生的代谢产物有关［31］。本研究筛选到的根际细菌DS7（Bacillus amyloliquefaciens）对大蒜根腐病病原菌抑制效果：对H5（Setophoma terrestris）抑制率达到51.72%，对H9（Fusarium solani）抑制率达到42.31%，实验结果表明，菌株DS7对大蒜根腐病病害具有较好拮抗效果。

产铁载体的PGPR能吸收土壤中的铁元素提供给植物，还能够抑制病原菌繁殖［32］。具备固氮能力、溶解磷能力的根际微生物，可以为自身和植物在一定程度上提供可利用的氮和磷，加快植物的生长速度［33-34］。PGPR菌，例如：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），能促进玉米生长，具有溶解无机磷、有机磷，分泌IAA能力［35］。Burkholderia sp.7016具有固氮、溶磷、产ACC脱氨酶，促进番茄生长及拮抗番茄土传病害等多种功能特性［33］。本实验研究筛选出的DS7具有多种功能特性：水解蛋白、产铁载体、固氮、溶解有机磷、无机磷和产IAA的能力。土壤酶活性反映了土壤中营养成分的转化以及土壤生物的生命活动能力的强弱。土壤中的酶活性与土壤中各种代谢过程和能量转换息息相关［36-37］，是土壤生物化学特征的重要组成部分。在评价土壤肥力、环境监测、衡量土地利用等方面有广泛的作用，可为土壤健康管理提供科学依据［38］。土壤中脲酶活性与土壤的微生物数量、土壤全氮、速效氮等密切相关［39］；蔗糖酶是一种重要水解酶，蔗糖酶断裂蔗糖分子键后产生葡萄糖、果糖，为植物和微生物提供营养的碳源［40］。土壤过氧化氢酶活性与土壤呼吸强度和土壤微生物活动相关，能有效防止过氧化氢的毒害，是重要的土壤微生态环境指示因子［40-42］。赵晶等［43］发现长期施用有机肥能够增加土壤中有机质含量，并且与土壤脲酶、磷酸酶和转化酶活性呈相关性。接种类芽孢杆菌（Paenibacillus spp.）后土壤酶活性与植物的生物量呈正相关，能够提高土壤质量，同时具有促进植物产量功能［44］。田间试验结果可看出，接种DS7（Bacillus amyloliquefaciens）后大蒜产量比对照组增产15.42%，接种DS7有助于提高产量。收集接种过DS7菌液的土壤和未做处理的对照组土壤，测定土壤中酶的活性，从过氧化氢酶活性指标可看出，DS7可能会抑制土壤中某些细菌的生命活动。但通过蔗糖酶活性及脲酶活性可看出，DS7可帮助土壤加快氨的转化速率，改善土壤肥力，起到改良土壤的作用。因此，DS7具备多种功效，对大蒜根腐病病原真菌有良好的拮抗效果，在增产的同时可以改善土壤肥力，是一种良好的微生物肥料资源菌种。