镉暴露诱导黄颡鱼鳃的组织学损伤、氧化应激和免疫反应

龚仕玲 谢冬梅 李英文 陈启亮

(重庆师范大学生命科学学院, 重庆市高校动物生物学重点实验室, 重庆 401331)

镉(Cd)是一种非必需、难降解的重金属元素,由于其具有良好的稳定性和防腐性, 一直以来被广泛应用于电池、油漆及染料等工业生产[1]。自20世纪50年代日本居民因食用“镉米”而引发“痛痛病”事件以来, Cd污染对人体健康的危害逐渐受到全世界的关注。水环境Cd污染主要来自含Cd废水的直接排放, 以及金属开采、冶炼等导致Cd在环境介质中积累, 并经雨水淋溶后进入水体[2]。通常, 自然水体中Cd浓度低于500 ng/L[3], 但我国部分污染水域Cd浓度远超过该值, 例如: 武汉东湖Cd浓度达8 μg/L[4], 山东省招远市玲珑金矿区Cd浓度高达194.5 μg/L[5]。鱼类长期暴露于Cd污染的水体中, 可导致体内Cd蓄积, 引起应激反应, 导致渗透压失衡[6]。胚胎暴露于Cd中会导致孵化率减少, 仔鱼Cd暴露会诱导畸形甚至死亡[7]。此外, Cd还能影响鱼体的能量代谢, 改变运动行为, 干扰内分泌系统[6, 8], 威胁鱼类的生存和生长, 并通过食物链危害人体健康。

鳃不仅是鱼类最主要的呼吸器官, 也是渗透压调节、酸碱平衡以及含氮废物排出的重要部位[9, 10]。因而, 维持鳃的正常结构和功能对于鱼类的代谢活动十分重要。然而, 鱼鳃直接暴露于水体中, 是有毒物质攻击的主要靶器官, 对水环境污染物尤为敏感, 其结构和功能的改变可反映水环境的变化, 因此可作为环境污染的指示器官[9, 11, 12]。截至目前,国内外已有一些关于水体Cd暴露影响鱼类鳃的结构及功能的研究报道[13, 14], 但这些研究大多关注Cd对鱼类的急性毒性效应, 而环境剂量Cd暴露下鱼类鳃的组织学改变及抗氧化反应的研究相对缺乏。此外, 关于Cd暴露诱导鳃的免疫调节的研究未见报道。

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)俗称黄腊丁,是一种底栖小型杂食性鱼类, 为我国重要的名优养殖品种之一[15]。本研究以黄颡鱼为对象, 将其暴露于50和200 μg/L Cd2+水体8周后, 分析鳃的组织学结构、抗氧化状态以及免疫相关基因的表达水平, 旨在揭示Cd对鱼类的毒理效应及毒理机制, 为水体重金属污染风险评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

氯化镉(CdCl2)为分析纯, 硝酸为优级纯, 均购自国药集团化学试剂有限公司; 抗氧化指标分析试剂盒购自南京建成生物工程研究所; RNA提取、逆转录及荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 实验设计

黄颡鱼购自重庆当地养殖场, 将其转移至室内养殖系统中进行为期2周的暂养。在实验开始时,选取180尾规格一致的健康鱼(平均体重为6.26 g)随机放入9个盛有200 L水的养殖缸中, 每缸20尾。然后, 向缸中加入已配好的CdCl2母液(对照组不加),使之分别暴露在Cd2+浓度理论值为0 (对照组)、50 μg/L(低剂量组)和200 μg/L(高剂量组)的水体中,每个浓度设置3个平行缸。不同实验组对应的实测值分别为(0.23±0.09)、(55.22±3.10)和(184.58±7.66) μg/L。在养殖期间, 每天投喂商业饲料2次(10:00和16:00), 投喂率为鱼体重的4%。此外, 为保持水质良好, 每天换水50%, 并补充相应的Cd2+。水质参数为: 水温(25.1±0.8)℃, pH 7.6±0.1, 溶氧(16.4±0.2) mg/L。光暗比为14h∶10h, 暴露时间为8周。

在暴露结束后, 黄颡鱼经MS-222麻醉后, 置于冰面上解剖获取鳃组织, 经PBS冲洗后分成3份: 一份浸入波恩氏液中固定, 用于组织学观察; 另一份经液氮速冻后储存在-80℃用于抗氧化指标和基因表达分析; 其余部分保存在-80℃用于Cd含量测定。

1.3 Cd含量测定

使用石墨炉原子吸收分光光度法检测鳃中Cd含量。首先, 将样品置于80℃烘箱中烘干至恒重后,称取约0.5 g样品, 加入10 mL浓硝酸, 置于消解罐中消解至冒白烟(消化液呈无色透明)。然后, 将消解液转移至容量瓶中定容, 并稀释至适宜浓度, 用石墨炉原子吸收分光光度计(岛津AA-6880)测定Cd含量。

1.4 组织学分析

鳃组织用波恩氏液固定24h后, 放入梯度乙醇中脱水。经二甲苯透明后, 放入石蜡中包埋。将包埋材料进行常规切片, 切片厚度为5 μm。采用苏木精-伊红(HE)染色, 中性树胶封片后拍照观察。

1.5 抗氧化指标分析

使用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定以下抗氧化指标: 还原型谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢(H2O2)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、抗羟自由基(AHR)的活性。测定时, 取鳃组织约0.5 g, 按1∶10 (w/v)加入预冷的生理盐水, 在冰上充分匀浆。然后, 将匀浆液转移至离心管中, 于4℃ 3000×g离心15min, 取上清液立即用于分析。分析方法严格按照试剂盒说明书进行。上清液的蛋白浓度以牛血清蛋白(BSA)为标准品, 采用考马斯亮蓝法测定。

1.6 基因表达分析

使用RNAiso Plus提取鳃组织总RNA。总RNA的质量和浓度分别用1%琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(Nanodrop ND-2000)检测。然后, 取1 μg总RNA, 用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒合成第一链cDNA。

采用CFX96实时定量PCR仪(Bio-Rad)检测基因的表达水平。10 μL反应体系为: SYBR Premix ExTaqTM5 μL, 上下游引物各0.4 μL (10 μmol/L),cDNA 1 μL, 无RNA酶水3.2 μL。反应程序为: 95℃30s, 95℃ 5s、60℃ 30s、72℃ 30s (40个循环), 并添加熔解曲线(60℃至95℃, 每升高0.5℃检测一次荧光信号值)。基因的相对表达量用2-ΔΔCt计算, 内参基因为18S rRNA。引物序列见表 1。

1.7 数据处理

试验数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示,采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析和Tukey多重检验, 当P＜0.05时视为差异显著。柱形图用GraphPad Prism 6进行绘制。

2 结果

2.1 Cd2+暴露对鳃中Cd含量的影响

如图 1所示, 随着水体Cd2+浓度升高, 鳃中Cd含量逐渐上升, 且高剂量组鳃中Cd含量显著高于对照组(P＜0.05)。低剂量组(47.5±13.5) μg/kg和高剂量组(174.6±8.8) μg/kg鳃中Cd含量分别是对照组(17.3±5.0) μg/kg的2.7倍和10.1倍。

2.2 Cd2+暴露对鳃组织学的影响

如图 2所示, 对照组鳃组织结构正常, 表现为鳃丝结构完整, 外层上皮细胞膜平滑, 毛细血管、柱细胞和上皮细胞形态正常(图 2A)。在低剂量组中,可见明显的组织学病变, 包括动脉瘤、细胞增生和鳃小片弯曲(图 2B)。在高剂量组中, 不仅有动脉瘤、细胞增生和鳃小片弯曲等病变, 还出现了细胞脱落的现象(图 2C)。

2.3 Cd2+暴露对鳃抗氧化指标的影响

如图 3所示, 随着水体Cd2+浓度的升高, CAT的活性逐渐降低, 而GPx的活性以及H2O2的含量逐渐升高, 且均在高剂量组差异显著(P＜0.05)。与对照组相比较, 低剂量组和高剂量组GSH的含量均显著降低, 而GST和AHR的活性显著升高(P＜0.05)。此外, Cd暴露对SOD的活性无显著影响(P＞0.05)。

表 1 qPCR引物Tab. 1 Primers used for qPCR

图 1 Cd2+暴露8周对黄颡鱼鳃中Cd含量的影响Fig. 1 Cd accumulation in gill of yellow catfish after 8 week exposure

2.4 Cd2+暴露对鳃免疫相关基因表达水平的影响

如图 4所示, 与对照组相比较, 肿瘤坏死因子-d(tnf-α)、主要组织相容性复合体(mhc)、白细胞介素-10(il-10)、转化生长因子-β(tgf-β)和补体因子C3(c3)的表达水平在低剂量组无显著变化(P＞0.05),而在高剂量组显著上调(P＜0.05)。此外, 在低剂量组和高剂量组中白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-8(il-8)及溶菌酶(lys)的mRNA水平均显著高于对照组(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 Cd2+暴露对鳃中Cd含量及组织学的影响

图 2 Cd2+暴露8周对黄颡鱼鳃组织学的影响(×400)Fig. 2 Effects of Cd2+ exposure for 8 weeks on histology of gill of yellow catfish (×400)

图 3 Cd2+暴露8周对黄颡鱼鳃中抗氧化指标的影响Fig. 3 Effects of Cd2+ exposure for 8 weeks on antioxidant-related parameters in gill of yellow catfish

在本研究中, 随着水体Cd2+浓度的升高, 鳃中Cd含量上升, 反映了鳃对水中Cd的富集效应, 这与在喀拉鲃(Catla catla)[16]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[17]中的研究结果相符。重金属在水生生物体内的积累通过以下途径实现: 一是鳃不断吸收水中的重金属离子, 然后积累在表面细胞中或通过血液输送到各个部位; 二是通过摄食, 经消化道进入体内; 此外, 体表与水体的渗透交换作用也可能是重金属进入体内的又一个途径[18]。因此, Cd在鳃组织的积累可能是以上3个途径的共同作用, 但鳃直接吸收水中Cd2+可能起主导作用。当重金属在体内蓄积到一定程度时, 会引起组织学病变。鱼鳃组织学是毒理学研究的重要生物指标[19]。在本研究中, Cd暴露损伤了鳃的组织结构, 包括动脉瘤形成、细胞增生、鳃小片弯曲以及细胞脱落等。类似地, Liu等[20]发现, 矛尾复虾虎(Synechogobiushasta)暴露于0.29 mg/L Cd2+水体15d后鳃出现动脉瘤和细胞增生; Thophon等[21]发现, 尖吻鲈(Lates calcarifer)暴露于20.12 mg/L Cd2+水体48h后鳃出现动脉瘤, 而72h和96h鳃出现细胞增生。这些组织学损伤一方面可能会影响鳃的呼吸功能; 但另一方面, 动脉瘤、细胞增生和鳃小片弯曲等组织学改变也是机体的一种防御机制, 即通过这些改变, 可以增加Cd到达血管的距离, 一定程度上阻止Cd进入细胞[22, 23]。

3.2 Cd2+暴露对鳃抗氧化指标的影响

图 4 Cd2+暴露8周对黄颡鱼鳃中免疫相关基因mRNA表达水平的影响Fig. 4 Effects of Cd2+ exposure for 8 weeks on the mRNA levels of immune-related genes in gill of yellow catfish

鱼类受到重金属胁迫时, 体内会产生大量活性氧(ROS), 如超氧阴离子(O2-)、羟自由基(·OH)和H2O2等[24]。如果这些ROS不能被及时有效地清除,将导致体内各种大分子如蛋白质、脂类等受到破坏, 造成氧化损伤, 进而影响鱼体组织和器官的正常生理功能[25, 26]。在抗氧化系统中, SOD-CAT系统是抵抗ROS的第一道防线[27], 其中, SOD将O2-转换成而CAT进一步将H2O2转换成水[29]。因此, 如果SOD活性不变, 而CAT活性降低则可能导致H2O2积累。在本研究中, Cd2+暴露对鳃中SOD活性无显著影响, 但显著抑制了CAT的活性, 从而使Cd暴露组中H2O2含量升高。GPx是机体内广泛存在的一种过氧化物分解酶, 可将有毒的H2O2带入无毒的羟基化合物(GSSG)中[30], 防止H2O2对细胞膜结构和功能的干扰和破坏。在本研究中, 高剂量组CAT活性降低的同时, GPx活性升高, 这可能是一种补偿机制, 表明GPx在鳃清除H2O2方面起关键作用。研究表明, 当鱼类受到低浓度Cd胁迫时, SOD、CAT和GPx活性均表现为升高, 而当受到高浓度Cd胁迫时, 这些酶的活性则表现为不同程度的降低, 其剂量-效应关系曲线为抛物线[31]。GSH是机体中重要的抗氧化剂和自由基清除剂。GST是一种生物转化酶, 催化有害物质与GSH的偶联反应,从而保护细胞免受氧化损伤[31]。在本研究中, Cd2+暴露导致GST的活性显著升高, 而GSH的含量显著降低, 这与Farombi等[32]的研究结果一致。GST活性增强是对鳃中Cd积累的适应性反应, 即鳃通过提升GST活性增加Cd与GSH之间的共轭, 以应对Cd引起的氧化应激[33]。GSH含量的减少表明鳃消耗GSH来清除有毒的代谢废物。·OH是最活泼也是最具危害性的自由基, 其氧化能力极强, 往往难以清除[34]。AHR活性是评估清除·OH能力的重要指标。在本实验中, 低浓度组和高浓度组AHR活性均显著高于对照组, 这进一步证实Cd暴露激活了鳃的抗氧化防御系统。

3.3 Cd2+暴露对鳃免疫相关基因表达水平的影响

鱼类的免疫系统在识别和清除外来抗原、抗感染及维持机体内环境稳定等方面发挥着至关重要的作用[35]。有研究表明, Cd暴露可引起鱼体先天性免疫和特异性免疫[36]。Cd影响先天性免疫功能主要表现在改变鱼体免疫相关酶活性、血液白细胞吞噬能力、补体溶血活性及血细胞呼吸爆发活性等[37, 38]。在特异性免疫方面, Cd暴露可导致鱼体血清总免疫球蛋白M含量显著升高[38]。此外, Cd对淋巴细胞有直接作用, 可抑制T、B细胞增殖和B细胞释放抗体, 也可抑制淋巴细胞DNA合成以及细胞膜上的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性,进而影响淋巴细胞的转化[6, 39]。在脊椎动物中, 免疫反应通常以炎症反应为特征[40]。在动物发生炎症时, TNF-α通常最先被释放[41]。TNF-α是促炎症细胞因子, 由免疫细胞释放, 与机体的各种炎症、感染和疾病密切相关[42]。MHC家族编码而成的分子位于细胞表面, 其主要功能是结合由病原体衍生的肽链, 从而在细胞表面显示出该病原体, 以便T细胞识别并执行一系列免疫功能[43]。已有研究表明mhc可被tnf-α调节[44]。在本研究中, Cd暴露上调了鳃中tnf-α和mhc表达水平, 表明Cd暴露诱导了鳃的免疫反应。白细胞介素(IL)是由淋巴细胞、单核细胞等产生的细胞因子, 在免疫调节、造血以及炎症过程中起着调节作用[45]。在本研究中, 与对照组相比, Cd暴露组鳃中il-1β和il-8的转录水平明显下调,而il-10的表达水平显著上调。促炎细胞因子il-1β和il-8的下调一方面可能是Cd诱导的免疫抑制效应, 另一方面也可能跟抗炎细胞因子il-10表达水平上调有关。TGF-β是抗炎和免疫抑制细胞因子, 参与细胞的生长、分化和免疫功能[46]。因此, 在本研究中tgf-β的上调可能是黄颡鱼免疫系统为修复Cd暴露所导致的鳃损伤的一种平衡机制。溶菌酶(LYS)是鱼类先天性免疫的重要组成部分, 由多种白细胞产生, 包括中性粒细胞和巨噬细胞[47]。已有研究表明, LYS与机体防御机制有关, 如抗病毒、溶菌、免疫应答等[48]。在本研究中, Cd暴露黄颡鱼8周后, 下调了鳃中lys的表达水平, 表明Cd暴露可能抑制了鳃的抗菌能力, 干扰黄颡鱼的先天性免疫系统, 反映了Cd对黄颡鱼的免疫毒性。此外, 补体在鱼类宿主防御方面起着关键作用, 启动后可参与机体靶细胞溶解[49]。在补体系统中, 补体因子C3是主要成分, 其在免疫防御、免疫调节和免疫病理中起着重要作用[49]。在本研究中, 高剂量组c3的表达水平显著上调, 表明补体系统被激活以抵御Cd暴露诱导的鳃损伤。

综上所述, 本研究表明, 黄颡鱼暴露于50和200 μg/L Cd2+的水体8周后, 其鳃中Cd积累, 并诱导鳃的组织学损伤、氧化应激和免疫反应。同时, 抗氧化系统和免疫系统在Cd诱导的鳃损伤中发挥了重要的保护作用。